Análise de DNA microbiano em campo usando um kit de extração biológica de campo e uma unidade qPCR de campo

O escopo da nossa pesquisa envolve realmente a realização de análises moleculares que podemos usar para caracterizar microrganismos envolvidos em remediação, mineração, prevenção de corrosão, e realmente nos ajuda a responder perguntas sobre sustentabilidade. Esta pesquisa aborda várias lacunas de pesquisa e acessibilidade por meio do uso de fluxos de trabalho de biologia molecular confiáveis e portáteis em campo, que são simples de usar. Destampe ambas as extremidades do filtro e conecte uma seringa de três mililitros cheia de ar ao filtro usando a conexão de bloqueio com luer.

Empurra o ar para expulsar a água residual. Desconecte a seringa e puxe mais ar antes de repetir. Depois, refaça a tampa vermelha da saída.

Inverta a solução em uma seringa para misturar. Remova a tampa da seringa de travamento Luer e conecte a seringa Solução A à entrada encapsulada do filtro de 0,2 micrômetro via a ponta de travamento Luer. Pressione o êmbolo para adicionar lentamente a Solução A. Depois, agite vigorosamente o filtro fechado com a mão por cinco minutos.

Agora, inverta a seringa da Solução B várias vezes para misturar. Remova a tampa de travamento Luer e conecte a seringa à entrada do filtro encapsulada via a ponta de travamento Luer. Após retampar a tampa do filtro de entrada, agite vigorosamente o filtro fechado com a mão por cinco minutos.

Remova a tampa da entrada e inverta o filtro. Use uma seringa de três mililitros acoplada à unidade de filtro encapsulada para empurrar um mililitro de ar para dentro do filtro. Depois, puxe o êmbolo para remover todo o lisado.

Transfira o lisado para um tubo de esferas de cinco mililitros. Depois de selar com parafilme, agite vigorosamente o tubo da conta por cinco minutos antes de colocá-lo na vertical. Coloque o cartucho de preparação da amostra em uma superfície plana e fixe uma coluna trancável Luer a uma seringa de um mililitro.

Use a ponta pontiaguda da coluna para fazer dois furos na primeira seção do cartucho de preparação de amostras. Pipete um mililitro de lisado do tubo da conta para o furo recém-perfurado na primeira seção do cartucho. Insira a coluna da seringa de volta na seção vermelha do cartucho.

Depois, puxe o fluido completamente para dentro da seringa e depois o expulse 10 vezes. Agora, posicione a ponta pontiaguda da coluna de seringa sobre a seção vermelho-alaranjada e perfure dois furos na barreira de alumínio. Usando o êmbolo, puxe todo o volume do fluido da seringa até dentro da seringa e bombeie o fluido completamente para fora.

Da mesma forma, use a coluna da seringa para perfurar e bombear as seções laranja, amarela, azul, seca ao ar e verde, puxando e empurrando o êmbolo o número de vezes indicado na seção. Depois, use a seringa de um mililitro e a coluna de preparação da amostra para transferir toda a solução da seção verde para um microtubo de um mililitro bem rotulado. Coloque até três amostras de DNA extraídas em campo na bandeja de amostras puras em lotes de um instrumento qPCR baseado em campo, garantindo uma amostra por seção designada.

Coloque as tiras de ensaio de cada amostra nos respectivos slots A, B ou C na bandeja, alinhando o primeiro poço de cada tira com o primeiro slot da bandeja. Desbloqueie o telefone e abra o aplicativo nomeado em homenagem ao instrumento qPCR registrado como marca. Quando o aplicativo abrir, toque no botão Iniciar Execução.

Na próxima tela, toque no botão Criar IDs. Insira as informações do exemplo tocando em Sample ID e digitando o nome da amostra. Toque nas unidades de amostra e selecione a unidade apropriada, depois toque sob a quantidade de amostra e insira o volume usado durante a extração.

Após inserir as informações de todas as amostras, toque no botão Continuar. Na próxima tela, toque no ícone da pasta e depois em Salvar na Pasta Atual. Digite o nome da sequência e toque em Confirmar.

Ligue o instrumento pressionando e segurando o botão de energia até que todas as luzes dianteiras acendam. Toque em Confirmar na inscrição para prosseguir. Pressione conectar via wireless integrado de curto alcance na aplicação.

Pressione o botão wireless de curto alcance integrado no instrumento até que a luz azul piscar. Depois, toque em Confirmar e selecione o nome do instrumento para conectar. Remova as tampas dos tubos de tira para a primeira amostra.

Adicione 18 microlitros de água estéril em cada poço e pipete suavemente para dissolver o pellet. Adicione dois microlitros de amostra a cada poço e feche os tubos com tampas de borracha para ensaio, garantindo a orientação correta. Toque em Confirmar na aplicação assim que todas as tiras estiverem preparadas.

Remova cada tira de ensaio. Verifique se há bolhas no fundo dos poços e depois balance suavemente a faixa até que as bolhas subam. Toque em Confirmar para prosseguir.

Abra a tampa do instrumento e coloque as tiras de ensaio no instrumento na ordem e orientação corretas. Feche a tampa até trancar e toque em Confirmar. Toque no botão Iniciar Execução no aplicativo para iniciar a execução.

Quando a corrida terminar, toque em Resultados por E-mail. Uma vez conectado à internet sem fio, toque em Enviar Novamente para transmitir os resultados. Limpe a bandeja cuidadosamente entre as corridas para evitar contaminação.

A conclusão bem-sucedida do isolamento de DNA usando o kit de campo de extração biológica foi confirmada por resultados consistentes de qPCR quando comparados a um método validado baseado em laboratório. A diluição padrão de cultura de Dehalococcoides analisada usando a unidade qPCR baseada em campo mostrou baixo desvio em 10 repetições tanto a 21 quanto a 30 graus Celsius. Testes de precisão dos instrumentos de campo mostraram desvio padrão relativo abaixo de 5% em todas as execuções.

Nossas descobertas realmente avançam o campo ao permitir que o monitoramento ambiental aconteça nesses locais remotos, e isso realmente promove a acessibilidade, o engajamento comunitário e gera pesquisas científicas muito impactantes. Nossos resultados abriram caminho para entender como as amostras mudam durante o envio em comparação com a extração e análise imediatas. Pesquisas futuras focarão em definir os limites desses métodos para amostras extremas como salmoura, bem como para condições climáticas extremas.