Métodos para Quantificação In Situ da Morfologia Mitocondrial em Células Musculares e Terminais de Schwann de Camundongos

Nossa pesquisa investiga pela primeira vez a morfologia mitocondrial das células terminais de Schwann na junção neuromuscular. Nossa abordagem permite quantificar a morfologia mitocondrial em tecidos de difícil acesso que seriam de outra forma, como leitos capilares e linfáticos. Para começar, obtenha um tipo coragem e um mouse D2-mdx.

Após confirmar a profundidade anestésica pelo reflexo de pinçar do dedo do pé, insira a agulha no tendão distal em direção ao joelho direito. Injete 50 microlitros de coloração mitocondrial fluorescente vermelho distante de dois micromolares no interior do músculo tibial, ou TA, enquanto retira a agulha ao longo do caminho da injeção, e incube o corante in vivo por uma hora. Enquanto mantém o animal sob anestesia, use tesoura e fórceps para dissecar e isolar o músculo TA antes da eutanásia.

Coloque o músculo TA isolado em paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 15 minutos. Depois, sob um microscópio estereoscópico, separe suavemente as fibras com provocação. Adicione a coloração de ácido nucleico permanente celular ao paraformaldeído de 4% para obter uma concentração final de cinco a dez microgramas por mililitro para marcação nuclear.

Depois, lave o músculo TA três vezes em PBS por cinco minutos cada para remover o excesso de corante. Desidrate o músculo sequencialmente com 50%75% e 100% etanol por cinco minutos cada. Em seguida, incube a amostra sequencialmente em soluções de limpeza de tecido um e dois por 30 minutos cada, garantindo que estejam totalmente submersas.

Coloque o músculo em uma capa. Use um bloco de vidro de 2,5 por 2 por 1 centímetro pesando 7,8 gramas para achatá-lo suavemente. Adquira um mouse beta S100.

Após confirmar a profundidade anestésica pelo reflexo de beliscão do dedo, faça uma pequena incisão na pele acima do músculo glúteo maior, ou GM. Injete 75 microlitros de coloração mitocondrial fluorescente vermelha de dois micromolares sob o músculo GM. Feche a ferida e deixe o contraste incubar por 45 minutos para marcar seletivamente as células terminais de Schwann.

Enquanto mantém o animal sob anestesia, disseque o músculo GM em até 10 minutos e imediatamente coloque-o em soro fisiológico gelado 0,9%. Somente se estiver usando camundongos de D2-mdx, adicione um corante fluorescente do receptor de acetilcolina em diluição de um a 500 no banho de microdissecação e incube o tecido por 30 minutos. Corte o excesso de gordura e tecido conjuntivo e transfira o músculo GM para um coverslip com o lado ventral voltado para baixo para microscopia invertida.

Adicione dois microlitros de meio de montagem geral na superfície dorsal do GM e achate o tecido usando bloco de vidro antes da imagem. No software, defina o comprimento de onda da excitação para 646 nanômetros. Após adicionar duas gotas da solução de limpeza dois, selecione a lente objetiva 63X para imagear o músculo TA e ajuste a profundidade do stack Z próxima a 100 micrômetros.

Depois, selecione o modo de deconvolução e aplique parâmetros otimizados para o sistema. Defina o tamanho do passo para um micrômetro e adquira imagens. Para adquirir imagens das células terminais de Schwann, selecione a lente objetivo de ampliação 20 vezes, ajuste a profundidade do stack Z para aproximadamente 17 micrômetros e adquira imagens.

Depois, selecione a lente objetiva com ampliação de 63 vezes e adquira imagens de células de Schwann terminais individuais. Importar fatias individuais de Z para treinar o software a reconhecer o sinal mitocondrial. E realizar análises quantitativas usando softwares impulsionados por IA.

Desenvolver máscaras de imagem para revisão pelo pesquisador. Empilhe imagens 3D separadas em seções ópticas individuais após otimização do algoritmo. Selecione cada quinto segmento Z de cada imagem 3D e calcule a média por amostra.

Padronize os parâmetros de imagem em todas as amostras e quantifique a morfologia mitocondrial. Realizar imunohistoquímica e análise estatística para avaliar diferenças e correlações entre grupos. A conectividade mitocondrial foi reduzida no músculo mdx em comparação com os camundongos do tipo selvagem.

Um número maior de pequenos fragmentos mitocondriais e um número reduzido de grandes redes mitocondriais interconectadas foram observados em camundongos mdx. Em camundongos selvagens, mitocôndrias em células terminais de Schwann apresentaram estruturas de laços interconectadas próximas a bifurcações. Em contraste, em camundongos mdx, as mitocôndrias aparecem fragmentadas e sem formação de alças próximas a bifurcações.

A microscopia confocal e eletrônica confirmou estruturas mitocondriais semelhantes em formato de rosquinha em células terminais de Schwann. A análise pós-sináptica mostrou mitocôndrias subsarcolemais agrupadas ao redor dos receptores de acetilcolina, sem a estrutura característica semelhante a pretzel. A análise de imagens revelou que as mitocôndrias terminais das células de Schwann no músculo mdx apresentaram maior área e fragmentação em comparação com o músculo do tipo selvagem, sem diferença no tamanho relativo das partículas.

As medições de força muscular mostraram redução dos espasmos com maior variabilidade e diminuição da força máxima no músculo mdx. A produção de força em frequências crescentes de estimulação também foi significativamente reduzida nos músculos MDX. O músculo mdx apresentou um deslocamento para a esquerda no tamanho das fibras, indicando miofibras aproximadamente 60% menores em comparação ao tipo selvagem.

Esse protocolo permite que pesquisadores estudem e quantifiquem a morfologia mitocondrial em músculos esqueléticos e células terminais de Schwann. Estudos futuros podem adaptar essa abordagem para investigar a morfologia mitocondrial em microcirculação e vasos linfáticos.