Um Modelo Pré-Clínico de Sinovite Utilizando Tecido Sinovial Humano Ex Vivo com Função e Arquitetura Preservadas

As principais questões que queremos responder são quais são a resposta imune sinovial nativa aos estímulos infecciosos e inflamatórios, e como isso se reflete nas alterações da estrutura sinovial? Meu foco principal clínico e de pesquisa é no tratamento de pacientes mórbidamente obesos com artrite reumatoide em estágio terminal. Frequentemente, nessa população de pacientes, eles têm sido negligenciados medicamente devido à dificuldade em encontrar opções de tratamento cirúrgico para sua doença.

Para começar, realize a artrotomia e dissecação na sala de operação. Use uma abordagem medial parapatellar padrão e realize uma exposição mais extensa ao operar um paciente com obesidade mórbida e osteoartrite em estágio terminal. Identifique o synovium anterior e use eletrocautério para dissecar o tecido.

Observe o joelho em busca de sinais de inflamação, pois pacientes com obesidade podem demonstrar uma resposta inflamatória local que se correlaciona com os efeitos inflamatórios mais amplos da obesidade. Passe o synovium para o membro da equipe de pesquisa de maneira estéril. Coloque o recipiente do espécime cheio com PBS de Dulbecco frio ou DPBS no gelo e transfira o tecido sinovial anterior humano adquirido durante a artroplastia total do joelho para o recipiente.

Lave o tecido duas vezes em DPBS frio por 10 minutos em uma placa rocker. Em seguida, transfira o synovium para uma placa de Petri estéril de 10 centímetros ou maior sob um gabinete de Nível de Biossegurança 2. Adicione DMEM estéril a frio com baixo teor de glicose contendo piruvato de sódio e L-glutamina para preencher a placa até a metade.

Identifique o revestimento sinovial pela camada íntima perolada sem descolá-la. Organize as ferramentas necessárias para obter núcleos de biópsia de três milímetros para pelo menos duas repetições técnicas. Usando tesouras de íris ou um bisturi, disseque o tecido adiposo e estroma supérfluo do lado cauterizado para isolar o synovium, mantendo uma profundidade de tecido de aproximadamente quatro a cinco milímetros ao longo de todo o processo.

Altere o meio da placa de Petri conforme necessário para manter o campo de visão. Posicione o tecido com o revestimento sinovial voltado para a ferramenta de perfuração. Estabilize o tecido com a mão não dominante usando fórceps ou hemostáticos, e perfure o tecido aplicando uma pressão perpendicular firme com torção suave.

Substitua o punção de biópsia após aproximadamente 10 a 15 usos, ou quando o tecido torcer durante a perfuração para evitar danificar a estrutura da camada íntima. Abra uma segunda placa de Petri e encha-a com cinco a dez mililitros de meio contendo 10%FBS temperado a 37 graus Celsius. Com fórceps planos ou sem dentes, transfira os núcleos para o prato e agite suavemente por um a dois segundos para lavar os detritos sem apertar-los firmemente.

Para preparar o poço inferior do Sistema de Análise do Espaço Articular, adicione 600 microlitros de DMEM com baixo teor de glicose contendo 10%FBS temperado a 37 graus Celsius. Adicione o controle do veículo ou o reagente de tratamento escolhido, como LPS ou MCP-1, ao poço inferior. Selecione o tamanho do poro do transwell com base no resultado experimental desejado e adicione 300 microlitros de DMEM com baixo teor de glicose contendo 10%FBS ao transwell.

Usando fórceps estéreis, transfira gentilmente núcleos de tecido individuais para o meio do transwell, evitando núcleos desfiados e flutuantes. Em seguida, coloque a montagem em um incubatório a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por oito a 72 horas, dependendo dos ensaios posteriores a serem realizados. Fixe o tecido sinovial em formalina tamponada neutra a 10%.

Em seguida, incorpore e secione-o para análise histológica. Após a coloração com hematoxilina e eosina, capture as seções de tecido em campo brilhante a 10X e 40X. Use o Photoshop para delinear as regiões da camada íntima e sublíngua na imagem TIFF 40X, mascarando áreas não-alvo, eritrócitos e grande vasculature para análise quantitativa subsequente.

Analise as máscaras finais para quantificar a espessura da camada íntima e sublíngua, integridade e celularidade. Finalmente, avalie as células migratórias por citometria de fluxo e os fatores solúveis no meio coletado por ensaio imunossorvente ligado a enzimas. O tecido sinovial cultivado com doses crescentes de MCP-1 ou LPS mostrou mudanças distintas na morfologia da camada íntima, incluindo camada íntima frágil e camada íntima espessada com densidade celular diminuída em comparação com o controle.

O tratamento com MCP-1 e LPS alterou a resposta de citocinas sinoviais. MCP-1 induziu a expressão do marcador de fibroblasto patogênico podoplanina no subrevestimento, enquanto o LPS aumentou a podoplanina tanto na camada íntima quanto no subrevestimento. As células imunes migratórias no poço inferior incluíam neutrófilos, células NK, células NKT, células T, células B, células dendríticas, monócitos ou macrófagos e macrófagos M2.

As células T foram as células imunes migratórias mais abundantes. Estatisticamente, não houve diferença na migração celular com base no estímulo do poço inferior. A osteoprotegerina, uma proteína relevante para a artrite, foi detectada em 24, 48 e 72 horas no synovium artrítico cultivado não tratado e foi significativamente mais alta em 72 horas do que em 24 horas.

A expressão da sintase de óxido nítrico induzida na camada íntima foi alta nos controles em zero horas e quase ausente após 24 horas. A expressão da sintase de óxido nítrico foi mantida quando tratada com N-acetil cisteína. Por outro lado, a N-acetil cisteína não alterou a expressão da metaloproteinase-9, um marcador tanto de sinovite quanto de potencial dano à cartilagem.

Este protocolo permite que os pesquisadores estudem as alterações nas camadas íntima e sublíngua sinoviais, incluindo profundidade, celularidade e integridade, o que é indicativo de inflamação. As considerações mais importantes ao realizar este protocolo são a aquisição de tecido viável de doadores apropriados, esterilidade e identificação da camada íntima para seleção de biópsia. Estudos futuros avaliarão a melhoria da duração da cultura de tecido viável para avaliar a regeneração da camada íntima sinovial.