Um método simplificado para a transformação mediada por agrobactérias de Phytophthora palmivora

Esse protocolo oferece um sistema simples, eficaz e reproduzível para transformar Phytophthora palmivora e Phytophthora capsici. Para começar, use uma nova placa de parafuso LB suplementada com antibióticos. Adicione 20 microlitros de meio líquido LB ao centro da placa e retire células agrobacterium de uma placa já cultivada com um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Usando a base inferior e plana do tubo, distribua as células uniformemente pela placa. Incube a placa durante a noite a 28 graus Celsius por aproximadamente 16 a 18 horas. Em seguida, retire as células de agrobactéria cultivadas durante a noite usando uma ponta de pipeta de um mililitro.

Resuspenda as células em um mililitro de meio de indução de agrobactéria pipetando para cima e para baixo. Agora, transfira as células ressuspensas para um tubo estéril de 50 mililitros coberto com papel alumínio e adicione o meio de indução de agrobactéria. Meça a densidade óptica da amostra em 600 nanômetros e dilua-a com meio de indução de agrobactérias para alcançar uma densidade óptica de 0,4.

Depois, afrouxe a tampa do tubo coberto de folha de alumínio que contém a suspensão bacteriana. Coloque-o em um tremor de plataforma com agitação suave a aproximadamente 70 rotações por minuto. Inunde uma placa de phytophthora palmivora de sete a oito dias com 10 mililitros de água pré-resfriada a quatro graus Celsius.

Use uma ponta de pipeta para bater suavemente na superfície e remover qualquer bolha de ar no substrato. Incube a placa a quatro graus Celsius por 15 minutos. Depois, transfira para a temperatura ambiente sob luz por mais 15 minutos.

Usando uma pipeta, transfira suavemente aproximadamente sete a oito mililitros de zoósporos liberados para um tubo centrífugo estéril de 15 mililitros sem perturbar micélios e esporângios. Depois, transfira 20 microlitros da suspensão do zoósporo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione 180 microlitros de água para diluir a suspensão dez vezes. Faça vórtice no tubo por um minuto para insistir nos zósporos e use um hemocitômetro ao microscópio para contar os zósporos.

Adicione cinco mililitros da suspensão preparada de agrobactéria a cinco mililitros da suspensão do zoospório em um tubo estéril coberto com papel alumínio de 50 mililitros. Misture delicadamente o conteúdo, afrouxe a tampa do tubo e deixe descansar em temperatura ambiente por duas horas. Durante a incubação, prepare as placas AZCA.

Quando o meio solidificar, coloque uma peça de membrana Hybond-N+ esterilizada sobre a placa e mantenha a placa no escuro. Após duas horas de co-incubação, use a ponta de uma pipeta para espalhar 300 microlitros da mistura sobre a membrana Hybond-N+, garantindo que as margens estejam livres do líquido. Deixe as placas de Petri destapadas no capuz por cerca de 10 minutos para deixar a mistura secar ao ar.

Quando o líquido parar de se mover na membrana, cubra as placas. Incube as placas cobertas a 25 graus Celsius no escuro por dois dias. Após 48 horas de incubação, utilize pinças esterilizadas para transferir a membrana Hybond-N+ de cabeça para baixo sobre a placa do parafuso Plich sem arrastá-la pela superfície do parafuso.

Use a base plana de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para pressionar e deslizar suavemente sobre a superfície da membrana, garantindo contato total com o meio. Verifique a parte inferior da placa para ver se há bolhas de ar e pressione suavemente usando a mesma base plana. Incube a placa a 25 graus Celsius sob um ciclo de luz de 12 horas e um ciclo de escuridão de 12 horas por dois a três dias.

Finalmente, após dois a três dias de incubação, remova a membrana usando pinças estérils e continue incubando a placa sob as mesmas condições de luz e temperatura. A co-incubação de zoósporos de Phytophthora palmivora com agrobacterium tumefaciens EHA 105 expressando pCB301TOR-GFP resultou em colônias resistentes a G418 no parafuso Plich suplementado com 30 microgramas por mililitro de G418, enquanto nenhuma colônia apareceu em placas controle sem infecção por agrobactéria. O número de transformantes resistentes a G418 por 10 elevado à potência de sete zoosporos foi 55 no experimento um e 50 no experimento dois.

Microscopia de fluorescência confirmou um sinal claro de proteína fluorescente verde em transformantes de Phytophthora palmivora. Além disso, esse protocolo foi aplicado a phytophthora capsici para gerar com sucesso transformantes que expressam GFP. Nosso protocolo permite que pesquisadores estudem funções gênicas, determinem a localização celular de proteínas e acompanhem a dinâmica da infecção por patógenos.

Esses protocolos podem gerar uma baixa porcentagem de falsos positivos e, portanto, exigem abordagens adicionais para confirmar os verdadeiros transformantes. A aplicação desse sistema de transformação pode ser estendida a outros oomicetos e fungos. Também tentaremos simplificar ainda mais esse protocolo no futuro.