Uma plataforma inovadora para alongamento celular in vitro e imagem

Nosso objetivo era desenvolver um dispositivo de alongamento celular compatível com microscópios de baixo custo, inspirado em Hoberman, para investigar como o estiramento mecânico influencia a função celular. Esse dispositivo permite que pesquisadores estudem as respostas das células vitais a estímulos mecânicos, imitando sistemas fisiológicos como um coração batendo ou pulmões respiratórios. Para começar, onde apropriado for o equipamento de proteção individual.

Misture a base e o agente de cura Silgard 184 em uma proporção de 10 para um em uma placa plástica. Com um depressor lingual, misture vigorosamente os componentes por dois a três minutos. Depois, coloque o recipiente em uma câmara de desgaseificação por uma hora.

Em seguida, pegue os moldes impressos em 3D preparados e adicione 1,3 gramas da mistura PDMS ao molde isotrópico. Depois, adicione 0,5 gramas da mistura de PDMS ao molde uniaxial. Espalhe o gel uniformemente pelo molde e desgaseie o molde cheio por uma hora.

Deixe o gel no molde se depositar em uma superfície plana em temperatura ambiente por duas horas. Depois, cure o mofo em um forno a 60 graus Celsius durante a noite. Em seguida, misture as partes A e B do gel NuSil 8100 em proporções iguais.

Misture o gel combinado com o reticulador silgard 184 a 0,36% do volume total para produzir uma rigidez do substrato de 13 quilopascal. Para produzir um substrato macio com rigidez de 0,3 kilopascal, evite adicionar o reticulador e depois misture a solução por 15 minutos. Coloque a mistura NuSil em uma câmara de desgaseificação e desgase por 30 minutos.

Agora remova cuidadosamente o gel PDMS do molde personalizado e coloque-o sobre uma capa de 40 milímetros sem rasgar. Em seguida, coloque o gel PDMS no codificador de spin. Pipete 100 microlitros da mistura NuSil na área negativa do gel isotrópico PDMS.

Depois, pipeteio 50 microlitros da mistura NuSil na área negativa do gel uniaxial PDMS. Depois disso, código a sete G por 50 segundos. Alcançar uma espessura de 100 micrômetros.

Deixe o gel revestido se depositar em uma superfície plana em temperatura ambiente por duas horas. Coloque o gel no forno e cure a 60 graus Celsius durante a noite. Agora seme as vias aéreas humanas, as células musculares lisas em poços de cultura elástica e incubam sob condições padrão.

Depois, misture as células com a solução de cálcio seis do FLIPR para exame de imagem. Para medição da força de tração, recubra os substratos do gel NuSil do PDMS com uma camada de esferas fluorescentes para servir como marcadores fiduciais. Prepare uma solução de 0,025% de microsferas vermelhas fluorescentes carboxilados modificadas com um micrômetro de diâmetro em HBSS.

Usando um misturador de vórtice, faça a solução da esfera por 10 segundos. Depois, pipetei 880 microlitros da solução da esfera para o gel isotrópico. Adicione 420 microlitros da solução da esfera ao gel uniaxial.

Após incubar o gel em temperatura ambiente por uma hora, remova cuidadosamente a solução da esfera para preservar a distribuição. Depois, use um cotonete ou lenço de laboratório para secar suavemente qualquer solução residual da superfície do gel. Em seguida, use um microscópio invertido equipado com câmera, motor leve e uma objetiva 10x seca.

Ajuste a excitação para 475 por 40 nanômetros e a emissão para 555 por 50 nanômetros. Adquira imagens de 16 bits a uma taxa de quadros de dois hertz durante experimentos de estiramento. Agora coloque gel isotrópico na maca e depois fotografe as esferas fluorescentes usando um microscópio invertido equipado com um objetivo seco 10x. Capture imagens na condição pré-estiramento.

Capture continuamente imagens ao longo do protocolo de alongamento no centro do substrato. Refocalizar o microscópio na posição esticada, se necessário, antes de capturar imagens. Analise as imagens usando código MATLAB personalizado baseado na microscopia da força de tração de Furier para calcular vetores de deslocamento e campos de deformação planar correspondentes.

Represente os dados como a média dos ensaios finais. Aplicar um deslocamento de 240 micrômetros fazia com que as esferas fluorescentes se deslocassem radialmente para fora a partir do centro. A microscopia de força de tração revelou um campo de deslocamento isotrópico com vetores irradiando do centro e aumentando de magnitude com a distância.

O campo de deslocamento isotrópico gerou um campo de deformação planar homogêneo. Aumentar o deslocamento para 1000 micrômetros resultou em vetores de deslocamento que aumentaram de magnitude mantendo a orientação radial. O campo de deformação correspondente a 1000 micrômetros aumentou em magnitude enquanto permaneceu radialmente simétrico.

Em géis uniaxiais submetidos a um deslocamento de 250 micrômetros, os vetores de deslocamento estavam predominantemente alinhados ao longo de um único eixo, consistente com a deformação uniaxial. As formas de onda de deformação espelhavam de perto os deslocamentos dos motores programados e permaneciam sincronizadas ao longo de três ciclos repetidos. Os valores de deformação no deslocamento máximo permaneceram consistentes em três amostras independentes.

Aplicando um deslocamento transitório de até 5.555 micrômetros produziu tensões que variam de mais de 0,1% a 12%. Uma tensão transitória de 0,5% induziu aumento do cálcio intracelular, evidente como maior intensidade de fluorescência após o esticamento. Usando nossa maca, os pesquisadores podem realizar imagens de cálcio com células vivas, microscopia da força de tração e quantificar respostas mecânicas celulares ao estiramento isotrópico ou uniaxial. Um passo crítico é garantir que os géis curem em uma superfície nivelada, pois espessura desigual pode desfocar o substrato e reduzir a clareza óptica durante imagens ao vivo.

Estudos futuros podem investigar a reorientação do citoesqueleto induzida por estiramento, condições patológicas de tensão relevantes para asma ou lesão pulmonar, e em diversos tipos celulares.