Modulação dependente de ligante colinérgico do acoplamento de fosforilação oxidativa em células de neuroblastoma BE(2)-C permeabilizadas por digitonina

O objetivo geral deste experimento é demonstrar um método para avaliar a bioenergética mitocondrial em células de neuroblastoma cultivadas intactas, utilizando permeabilização seletiva e combinação de inibidores de substrato. Tradicionalmente, a respiração mitocondrial é avaliada usando instrumentos como o respirômetro de alta resolução Oroboros O2K, o eletrodo de oxigênio tipo Clark e o analisador Seahorse XF. Métodos tradicionais que dependem de fração mitocondrial isolada ou enriquecida de tecidos ou células frequentemente comprometem a estrutura mitocondrial.

Por exemplo, essa imagem de microscópio eletrônico de transmissão das mitocôndrias isoladas do córtex de camundongo revela um contraste distinto na integridade estrutural, dependendo se as mitocôndrias estão ou não encapsuladas dentro dos terminais pré-sinápticos. Mitocôndrias que permanecem encapsuladas dentro dos terminais pré-sinápticos parecem estruturalmente intactas, como indicado pelas setas ciano nesta imagem. Em contraste, mitocôndrias que não estão encapsuladas ou não possuem estrutura membranosa ao redor frequentemente aparecem deformadas, como representado pelas setas amarelas.

O analisador Seahorse Flex é comumente usado para estudar a bioenergética mitocondrial tanto em células cultivadas quanto em mitocôndrias isoladas. Na análise baseada em células cultivadas, a arquitetura celular e as redes de sinalização são preservadas. No entanto, a membrana plasmática das células intactas é impermeável a muitos substratos do ciclo do ácido tricarboxílico.

Isso limita o escopo da análise metabólica em comparação com mitocôndrias isoladas, que não possuem barreira de membrana plasmática, mas frequentemente exibem artefatos estruturais. Assim, ambos os sistemas possuem limitações inerentes. A técnica apresentada aqui explora o fato de que a membrana plasmática é rica em colesterol, enquanto a membrana mitocondrial contém muito pouco.

Ao usar um detergente que liga o colesterol, como a digitonina, podemos permeabilizar seletivamente a membrana plasmática enquanto deixamos a membrana mitocondrial intacta. Essa abordagem permite a entrada controlada de substratos e inibidores mitocondriais na célula sem comprometer a integridade dos organelos. Assim, essa técnica possibilita a análise funcional de mitocôndrias no contexto de células intactas, combinando a vantagem da arquitetura celular inteira com o acesso a ensaios mitocondriais isolados.

Comece o experimento com um prato de cultura sub-confluente das suas células. Lave as células suavemente com um tampão estéril de fosfato. Adicione um volume apropriado de solução Triton para cobrir uniformemente a monocamada celular. Após a incubação, retire o recipiente e bata ou agite suavemente na horizontal para ajudar a deslocar as células.

Usando uma pipeta de cinco ml e um controlador de pipeta, pipete a suspensão da célula várias vezes para quebrar qualquer aglomerado e obter uma suspensão de célula única. Examine a suspensão celular ao microscópio para confirmar uma suspensão uniforme de célula única. Conte as células usando um hemocitômetro ou contador celular automático.

Ajuste a concentração celular para que 100 microlitros da suspensão contenham aproximadamente 10.000 células. Acelere cuidadosamente 100 microlitros da suspensão da célula em cada poço da placa de ensaio Seahorse XF. Deixe um bem vazio para servir como controle de fundo durante o ensaio.

Incube a placa em uma incubadora de cultura celular por duas a três horas para permitir que as células aderam ao fundo do poço. Depois que as células estiverem ligadas, adicione suavemente 300 microlitros de meio de ensaio em cada poço. Retorne a placa à incubadora e incube durante a noite para permitir que as células se estabilizem e cresçam.

Certifique-se de que as células formem uma camada monocamada uniforme no fundo de cada poço. Evite superlotação. As células devem ser confluentes, mas não excessivamente confluentes, para garantir o desempenho ideal do ensaio.

Na noite anterior ao experimento, hidrate o cartucho sensor XFp 24 adicionando um ml de buffer de calibração a cada poço. Alternativamente, você pode usar soro tampão fosfato, pH 7,4. Deixe o cartucho em temperatura ambiente durante a noite na cama.

Incubação em uma incubadora sem COT a 37 graus centígrados não é necessária, pois o cartucho se equilibra à temperatura ambiente durante o processo de carregamento. Chame todas as soluções congeladas de estoque e 2x tampão de ensaio microglial em temperatura ambiente. Verifique o pH, deve ser 7,4.

Ajuste se necessário. Prepare todo o substrato e as soluções de injeção e verifique o pH novamente. Deixe todas as soluções no gelo até o uso.

Prepare tubos de alimentação rotulados com A, B, C e D para soluções de porta de injeção de cartuchos de sensor. É melhor fazer soluções contendo inibidores ou substratos respectivos para cada porta. Usando uma pipeta multicanal, carregue cuidadosamente 50 microlitros de cada solução de porta de injeção nos respectivos portos, de A a D.

Inicie o bioanalisador Seahorse uma a duas horas antes do experimento para permitir que a incubadora interna se estabilize a 37 graus centígrados. Rotule cada poço e agrupe de acordo com seu desenho experimental e as diretrizes do Wave Desktop 2.6. Programe o bioanalisador para a mistura, peso e ciclo de medição adequados.

Veja a tabela 8 para referência. É importante desativar a opção de equilíbrio no início do ciclo de medição. Mantê-lo desnecessariamente prolonga o experimento e pode esgotar os substratos.

Inicie a máquina primeiro calibra o cartucho sensor, o que leva aproximadamente 15 minutos. Comece a preparar a placa de células logo após colocar o cartucho sensor em calibração. Aspire cuidadosamente o tampão sem perturbar as células em aproximadamente 700 microlitros de 1x de ensaio mitocondrial para cada poço com células aderentes, e deixe a placa repousar por um minuto para se equilibrar.

Aspire cuidadosamente o tampão de cada poço sem perturbar as células aderentes. Repita o passo da máquina de lavar três vezes para garantir o meio completo. Paralelamente, adicione 50 microlitros de tampão de ensaio mitocondrial a um poço de fundo sem células.

Use o menisco como referência visual para consistência de volume. Aspire cuidadosamente o tampão dos poços que contêm células, deixando aproximadamente 50 microlitros para manter a hidratação celular. Incube a placa a 37 graus centígrados, seja em banho-maria, mantendo-a acima da superfície da água ou em uma incubadora não de aço com a atmosfera saturada para evitar a evaporação.

Logo antes de carregar no analisador, adicione 450 microlitros de tampão de ensaio mitocondrial pré-aquecido contendo substratos, inibidores ou medicamentos conforme necessário em cada poço, elevando o volume total para 500 microlitros. A placa agora está pronta para executar o ensaio usando o cartucho sensor calibrado no bioanalisador Seahorse. Primeiro, realizamos um ensaio de acoplamento para examinar o grau de acoplamento entre o sistema de transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa.

O ensaio de acoplamento ajuda a distinguir a função mitocondrial da disfunção. Neste diagrama do sistema de transporte de elétrons mitocondriais, mostramos inibidores específicos complexos um, três e cinco, juntamente com os nós para diferentes substratos como piruvato ou malato e succinato, que doam os elétrons ao sistema. Essa visualização é útil para entender como o ensaio opera e o papel de vários substratos e inibidores.

Primeiro examinamos duas concentrações diferentes de digitonina, cinco micromolares e 10 micromolares, quanto à sua eficácia em facilitar o transporte de elétrons através da membrana plasmática e viabilizar o ensaio de acoplamento. Neste ensaio, o nível de acoplamento respiratório foi avaliado medindo sequencialmente a taxa de consumo de oxigênio na presença de succinato como substrato e rotenona como inibidor complexo de um um. ADP, oligomicina, FCCP e antimicina A foram então injetados sequencialmente, e as medições de OCR foram registradas após cada injeção.

O painel à esquerda mostra gráficos lineares que mostram a cinética da tensão de oxigênio dentro da microcâmara transitória. Normalmente, esse valor deve permanecer entre 100 e 200 milímetros de mercúrio para garantir a detecção dentro da faixa dinâmica do sensor. Esses conjuntos de dados foram gerados usando o modo ponto a ponto no software Agilent Wave, que exibe o OCR como uma série de taxas ao longo do período de medição, permitindo visualizar mudanças dinâmicas, notadamente 10 micromolares digitoninas aumentaram o transporte succinato em comparação com cinco micromolares, resultando em menor tensão de oxigênio na microcâmara e, consequentemente, maior absorção de oxigênio.

A análise gráfica dos dados obtidos nesses experimentos revelou que a respiração basal mediada pelos complexos dois a quatro foi significativamente maior, com 10 micromolares digitoninas em comparação com cinco micromolares, indicando um transporte succinado mais eficiente através da membrana plasmática permeabilizada na maior concentração. Com base nessa observação, e considerando que 10 micromolares de digitonina proporcionaram permeabilização ideal, reduzimos o número de células para 20.000 células por poço para diminuir a respiração basal. Esse ajuste garantiu que qualquer aprimoramento respiratório induzido por medicamento ou substrato permanecesse dentro da faixa dinâmica de detecção do sistema.

Uma vez otimizada a concentração de digitonina e o número de células, foi realizado o próximo ensaio de acoplamento para avaliar os efeitos dos agonistas muscarínicos e antagonistas na respiração mitocondrial. Uma descoberta importante desse conjunto de experimentos foi que, em células digitoninas não tratadas, a respiração basal mediada por complexos impulsionados por succinatos dois a quatro, assim como a respiração State-3 e State-3U, foi significativamente reduzida. Isso indica que a succinato não foi transportada para dentro da célula sob condições não permeabilizadas.

A análise dos dados de múltiplos experimentos independentes revelou que o antagonista muscarínico atropina reduziu significativamente a respiração basal mediada por complexos dois a quatro na célula neuroblastoma, em comparação com o agonista muscarínico acetilcolina, que manteve alto nível respiratório. Além disso, tanto a respiração de Estado 3 quanto de Estado 3u foram significativamente menores em células não permeabilizadas do que em células permeabilizadas, ressaltando a eficácia da digitonina na permeabilização seletiva da membrana plasmática sem prejudicar a função mitocondrial. O ensaio de fluxo de elétrons avalia a transferência sequencial de elétrons para a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, ajudando a identificar mecanismos de disfunção ou modulação mitocondrial.

Na fase inicial do ensaio, as células foram tratadas com piruvanato, malato e FCCP, que induziram um alto nível de respiração desacoplada impulsionada por complexos um a quatro. A adição subsequente de rotenona inibiu o complexo um, reduzindo a respiração basal e isolando a atividade do complexo dois a quatro. Embora não tenhamos observado diferenças significativas entre condições tratadas por medicamentos e o controle, uma observação importante foi que a respiração State-3U conduzida por succinatos foi significativamente menor em células não permeabilizadas, indicando o papel crítico da digitonina na entrada dos succinados na célula.

Em resumo, esse protocolo oferece uma forma confiável de estudar a bioenergética mitocondrial. Ele combina a relevância fisiológica da arquitetura celular inteira com a precisão de ensaios mitocondriais isolados, permitindo a entrega controlada de substratos e inibidores, preservando a integridade dos organelos. Ao otimizar a concentração de digitonina e a densidade celular, os pesquisadores podem alcançar medições precisas e reprodutíveis.

Essa abordagem adaptável é ideal para explorar a modulação mediada por receptores da função mitocondrial e oferece uma plataforma poderosa para pesquisa de doenças e descoberta de medicamentos.