Perfil de Acessibilidade por Cromatina em Larvas Plenas de Caenorhabditis elegans L4
17 de abril de 2026
Aqui, apresentamos um protocolo ATAC-seq rápido e simples a ser implementado em um verme inteiro de estágio L4 Caenorhabditis elegans usando apenas 30 μL de pellet de verme.
Nossa pesquisa se concentra em como a regulação epigenética molda a expressão gênica, especificamente como a acessibilidade da cromatina controla a atividade gênica em diferentes condições biológicas. O ATAC-seq em C. elegans é limitado por sua cutícula protetora. Nossos protocolos superam essa barreira para permitir uma análise confiável da acessibilidade da cromatina.
Para começar, obtenha uma população síncrona de vermes L1 e permita que cresçam por 26 horas a 20 graus Celsius. Confirme ao microscópio que a maioria dos vermes está no estágio L4. Recolha todos os vermes das placas com tampão M9 e transfira-os para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.
Lave os vermes cinco vezes com um mililitro de água estéril, deixando-os se assentar por gravidade. Em seguida, transfira o tubo contendo os vermes para um incubador a 25 graus Celsius por 30 minutos para remover os restos alimentares intestinais. Então, pegue 50 microliters do pellet de vermes e coloque-o em um novo tubo.
Para lisar os vermes, adicione 200 microliters de tampão SDS-DTT fresco e misture em um rotador de tubo por exatamente cinco minutos. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de ovo frio. Em seguida, centrifugue em um picofuge para remover o sobrenadante e repita seis vezes.
Depois disso, adicione 80 microliters de pronase recém-preparada. Usando uma pipeta de 200 microliters com pontas filtradas, misture a mistura de vermes e pronase 70 vezes e incube-a à temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione 800 microliters de meio L15 com 10% de soro bovino fetal e centrifugue a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Após a remoção do sobrenadante, adicione um mililitro de meio L15 com 10% de soro bovino fetal e centrifugue como demonstrado anteriormente. Uma vez que o pellet seja lavado três vezes, remova o sobrenadante e ressuspense o pellet em 900 microliters de meio L15 com 10% de soro bovino fetal. Em seguida, filtre a suspensão usando um filtro de 20 micrômetros.
Centrifugue a suspensão celular filtrada a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante, deixando aproximadamente 50 microliters. Adicione 45 microliters de tampão de lise fresco e ressuspense cuidadosamente a amostra.
Em seguida, adicione cuidadosamente 50 microliters de tampão de lavagem sem misturar a amostra. Centrifugue a 500G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e mantenha a amostra no gelo.
Enquanto centrifuga, prepare a mistura TN5 por amostra combinando 25 microliters de tampão TN5, 24,8 microliters de água livre de nuclease e 0,2 microliters de enzima TN5. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e mantenha os núcleos no gelo. Adicione 50 microliters da mistura TN5 ao pellet nuclear.
Em seguida, pipete para cima e para baixo sete vezes para misturar. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos em um bloco térmico e bata suavemente o tubo a cada 10 minutos. Após a incubação com TN5, adicione 300 microliters de tampão PB e misture vortexando à velocidade máxima por 25 segundos.
Transfira todo o volume do tubo para a coluna de centrifugação. Centrifugue à temperatura ambiente por um minuto na velocidade máxima. Adicione 750 microliters de tampão PE à coluna de centrifugação e centrifugue novamente.
Em seguida, descarte o sobrenadante com o tubo de coleta. Após uma centrifugação vazia, coloque a coluna em um novo tubo de 1,5 mililitros rotulado. Adicione 10 microliters de tampão EB a 37 graus Celsius no centro da coluna sem tocá-la.
Deixe-o à temperatura ambiente por um minuto. Em seguida, centrifugue por um minuto na velocidade máxima à temperatura ambiente. Em seguida, repita as etapas de eluição para obter um volume final de 20 microliters em tampão EB.
Realize uma PCR em tempo real para estimar o número de ciclos de amplificação adequado para amplificação da biblioteca ATAC. Estime o número final de ciclos de amplificação selecionando o ciclo em que o sinal de amplificação atinge 1/3 de seu máximo para cada amostra. Realize a amplificação final para a biblioteca ATAC e atribua um primer reverso diferente a cada amostra e registre-o.
Amplifique cada amostra pelo número de ciclos estimado para aquela amostra. Realize a reação em cadeia da polimerase apresentada em tubos de 200 microliters usando 10 microliters de biblioteca de DNA em um volume total de reação de 50 microliters. Armazene as amostras a menos 20 graus Celsius se pausar o protocolo.
Após purificar a biblioteca amplificada, realize a eletroforese capilar para ver o padrão de distribuição do tamanho do fragmento. A curva de amplificação resultando em uma amplificação final da biblioteca estimada de menos de 15 ciclos indica material de boa qualidade adequado para continuação. A curva de amplificação mostrando um aumento retardado indica material de má qualidade e não deve ser continuada.
A distribuição de comprimento dos fragmentos após a amplificação mostrou padrões nucleossomais em aproximadamente 150 pares de bases e 300 pares de bases em amostras válidas. Um padrão de fragmentos manchados indicava DNA excessivamente fragmentado, exigindo repetição da amostra. Nosso protocolo permitirá o perfil de acessibilidade da cromatina em todo o genoma em vermes inteiros para entender como os ambientes influenciam a regulação gênica.
O principal desafio é equilibrar a entrada de vermes e a atividade do TN5 para evitar tagamentação insuficiente ou excessiva, garantindo um perfil de acessibilidade da cromatina ideal. Essa abordagem abre oportunidades para estudar a variação epigenética em isolados selvagens, condições ambientais e até mesmo espécies alternativas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo otimizado para realização de ATAC-seq (ensaio de cromatina acessível à transposase com sequenciamento) em vermes inteiros de Caenorhabditis elegans no estágio de desenvolvimento L4. O método supera os desafios impostos pela cutícula rica em colágeno do nematodo, permitindo o perfilamento eficiente da acessibilidade da cromatina em todo o genoma com número mínimo de células. O fluxo de trabalho simplificado facilita estudos sobre a dinâmica da cromatina em resposta a alterações genéticas e ambientais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genômica
- Epigenética
- Biologia Molecular
Antecedentes
- A acessibilidade da cromatina é crucial para a transcrição, reparo do DNA e segregação cromossômica.
- Regiões de cromatina hiperacessíveis estão associadas a promotores e enhancers ativos.
- O ATAC-seq permite o mapeamento em todo o genoma de regiões de cromatina acessíveis utilizando poucas células.
- A implementação em C. elegans é desafiadora devido à cutícula de colágeno resistente do organismo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver e apresentar um protocolo otimizado de ATAC-seq para vermes inteiros de C. elegans.
- Permitir o perfilhamento eficiente da acessibilidade da cromatina no estágio L4.
- Reduzir as barreiras técnicas para o ATAC-seq neste organismo modelo.
Métodos Utilizados
- Cultura sincronizada de C. elegans no estágio L4.
- Disrupção da cutícula e dissociação enzimática para obtenção de suspensões celulares.
- Preparação de núcleos permeabilizados para transposição por Tn5.
- Amplificação por PCR e purificação de bibliotecas prontas para NGS.
Resultados Principais
- O protocolo requer apenas 30 μL de pellet de vermes.
- O fluxo de trabalho completo pode ser concluído em um único dia.
- Gera entre 5.000 e 9.000 picos de acessibilidade da cromatina na linhagem de referência Bristol N2.
- O método é adaptável a outros estágios de desenvolvimento ou populações celulares purificadas por FACS.
Conclusões
- Este protocolo ATAC-seq otimizado permite um perfil robusto de acessibilidade da cromatina em vermes inteiros de C. elegans.
- Amplia as oportunidades para estudar a dinâmica da cromatina em todo o genoma em resposta a diversas perturbações.
- O fluxo de trabalho simplificado reduz as barreiras técnicas para pesquisadores que utilizam este organismo modelo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O perfilamento da acessibilidade da cromatina em todo o genoma em larvas L4 inteiras de Caenorhabditis elegans permite a investigação direta das paisagens regulatórias em um organismo multicelular intacto. Este fluxo de trabalho otimizado de ATAC-seq reduz as barreiras técnicas, apoiando a confiança preditiva em estudos de regulação gênica e facilitando a desvinculação mecanicista em estágios iniciais de descoberta. A adaptabilidade do protocolo aumenta seu valor para validação de alvos em toda a carteira e iniciativas de genômica funcional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite o mapeamento de alta resolução de regiões de cromatina acessível para validação funcional de alvos.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas ao revelar a atividade de elementos reguladores em um contexto de organismo inteiro.
- Facilita a investigação orientada por hipóteses sobre redes reguladoras de genes relevantes para modelos de doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um fluxo de trabalho padronizado para gerar dados reprodutíveis de acessibilidade da cromatina a partir de pequenas quantidades de amostra.
- Fornece saídas quantitativas de picos adequadas para análise comparativa entre condições genéticas ou ambientais.
- Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente de perturbações regulatórias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Permite a avaliação da dinâmica da cromatina em resposta a perturbações genéticas ou ambientais em um modelo relevante para a doença.
- Apóia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, vinculando alterações regulatórias a desfechos fenotípicos.
- Oferece uma plataforma para identificar biomarcadores translacionais do estado da cromatina quando apoiado por estudos adicionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de ATAC-seq integra-se ao continuum de descoberta desde a validação inicial de alvos até a pesquisa pré-clínica, permitindo um perfilamento robusto da cromatina em organismos inteiros.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao mapear elementos regulatórios acessíveis.
- Triagem: Fornece dados reprodutíveis e quantitativos de acessibilidade da cromatina para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Gera contagens de picos e perfis em todo o genoma para comparar estados regulatórios em diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Facilita a investigação de alterações na cromatina associadas a perturbações relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Um fluxo de trabalho adaptável apoia ampla aplicação em diferentes estágios de desenvolvimento e populações celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos de mecanismos regulatórios e validação de alvos.
- Valor Operacional: Agiliza o perfilamento de cromatina com um protocolo escalonável de um dia que exige quantidade mínima de material de entrada.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer dados epigenômicos robustos e reprodutíveis.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e vias com base em evidências de acessibilidade da cromatina.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manejo de nematoides, dissociação celular e preparação de bibliotecas para sequenciamento de nova geração (NGS).
- Exige acesso à infraestrutura de sequenciamento de nova geração e suporte em bioinformática para análise de dados.
- A padronização entre equipes é essencial para a reprodutibilidade e a comparabilidade entre estudos.
- O protocolo pode ser adaptado a outros estágios de desenvolvimento ou populações celulares purificadas por FACS, conforme necessário.
- Limitações técnicas podem surgir do tamanho da amostra de entrada ou da eficiência da disruptura do cutícula.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:23
Isolation and Dissociation of Caenorhabditis elegans into Single-Cell Suspension
2:47
Nuclei Isolation and Chromatin Tagmentation for ATAC Sequencing
5:25
ATAC Library Amplification and Cycle Optimization Using qPCR
6:36
Results
7:25
Conclusion
