Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA
17 de abril de 2026
Este protocolo descreve um método para isolar RNA de regiões histológicas definidas de tecido hepático de camundongo, fixado com paraformaldeído, composto de Temperatura Ótima de Corte, utilizando microdissecação por captura a laser, permitindo análise direcionada de expressão gênica a jusante.
Nossa pesquisa investiga principalmente a fisiopatologia relacionada a hepatócitos no contexto de doenças crônicas do fígado. Esse protocolo permite o isolamento celular em fatias de tecido hepático e a extração de RNA. Ao contrário do FFPE, ou protocolo Paraformaldeído fixo ou CT, preserva e itegrida, permitindo uma microanálise precisa e amostras de alta qualidade para análise OMI a jusante.
Para começar, expor as lâminas de membrana da caneta à luz ultravioleta em quatro minutos e meia. Cubra as lâminas com 0,1 miligrama por mililitro de polilisina L e deixe-as secarem ao ar. Sele as bordas de cada ferrolho com um meio de montagem neutro.
Usando um agente de descontaminação de RNase, limpe todas as superfícies acessíveis do criostato e todas as ferramentas. Usando 75% de etanol. Limpe bem a escova e as ferramentas.
Agora, ajuste a temperatura do criostato para menos 20 graus Celsius e deixe estabilizar. Retire as amostras de fígado do armazenamento a menos 80 graus Celsius. Coloque as amostras na câmara do criostato por pelo menos 15 minutos para se equilibrar.
Aplique uma camada de composto OCT de dois a três milímetros de espessura sobre a etapa da amostra. Depois, coloque a etapa da amostra em uma prateleira livre rápida ou dentro da câmara do criostato para pré-solidificar a camada composta. Após aplicar uma pequena quantidade de composto OCT sobre a camada pré-solidificada, coloque o bloco de tecido equilibrado horizontalmente sobre o composto e mantenha-o no lugar por 10 a 15 segundos.
Em seguida, montar o estágio da amostra com o bloco de tecido acoplado na cabeça da amostra criostatica. Agora insira a lâmina cuidadosamente entre as placas de fixação e as placas traseiras de um lado do criostato. Prenda a alavanca de fixação para fixar a lâmina.
Ajuste a espessura do criostato para 10 micrômetros. Corte o tecido em seções e monte-as diretamente sobre as lâminas de membrana pré-tratadas dentro da câmara do criostato, mantidas a menos 20 graus Celsius. Descongele os slides em temperatura ambiente por 20 minutos.
Lave os slides três vezes com PBS livre de RN ACE quatro vezes em cada lavagem de 10 segundos. Adicione a solução filtrada de hematoxilina de Mayer nas seções do tecido por cinco a dez segundos. Depois, lave as lâminas três vezes com água sem ribonuclease por 10 segundos a cada lavagem para remover a hematoxilina residual.
Avalie a qualidade da coloração ao microscópio. Usando papel absorvente, seque as lâminas e deixe secar completamente ao ar. Limpe a superfície da bancada de laboratório com agente de descontaminação RNase.
Ligue o controlador e permita que o microscópio complete a inicialização. Gire a tecla no sentido horário da posição desligada para a posição ligada para iniciar o sistema laser. Ligue o computador e inicie o software de microdissecação de captura a laser.
Depois, aguarde a inicialização ser concluída. Agora insira um tubo PCR estéril de 0,2 mililitros no dispositivo de coleta. Usando uma pipeta, adicione 10 microlitros de protease K tampão de digestão na tampa do tubo de PCR.
Carregue o dispositivo de coleta no suporte para amostras do microscópio. Na janela do dispositivo coletor de alterações. Vá para ajustar o ponto de referência, ajuste o foco da câmera para visualizar claramente o ponto de referência e use os controles de seta para centralizá-lo se necessário.
Carregue uma seção de tecido no suporte da amostra com o tecido voltado para baixo e a posição do rótulo à direita. Selecione a lente objetiva 10 x e identifique regiões de interesse com características patológicas específicas. Navegue até o menu laser.
Clique em calibrar, selecione sim e complete a calibração. No painel de controle do laser, ajuste a potência do laser para 50, abertura para cinco e velocidade para nove. Depois, use a barra de ferramentas gráfica para desenhar um círculo ao redor da área de destino.
Selecione uma única forma, pressione start cut para realizar microdissecação de captura a laser e posicione o dispositivo de coleta para coletar o tecido dissecado. Para capturar documentação, imagens, selecione o arquivo e escolha salvar imagens para salvar imagens antes e depois no formato preferido. Após coletar as células desejadas, clique em descarregar para remover o coletor do palco.
Verifique se 10 microlitros de protease K tampão de digestão permanecem na tampa e reabasteça se necessário. Feche o tubo e faça um vórtice completo. Depois, gire o tubo brevemente em uma centrífuga.
Armazene o tubo a menos 80 graus Celsius até a extração de RNA. A seção hepática colorida com hematoxilina na lâmina da caneta foi visualizada ao microscópio antes e depois da microdissecção por captura a laser. Regiões de interesse que apresentam esteatose microvesicular foram coletadas com precisão na tampa do tubo A de PCR.
Preservando a morfologia celular intacta. O ácido ribonucleico total extraído de aproximadamente 1000 e 2000 células isoladas de microdissecação por captura a laser produziu 110,7 nanogramas e 213,3 nanogramas, respectivamente. Todas as amostras apresentaram alta pureza com razões de absorção de 260 por 280 nanômetros entre 1,9 e 2,1.
A eletroforese em gel revelou bandas distintas de ácido ribossomal 28 s e 18 s. Perfis de bioanalisadores de ácido ribonucleico de apenas 1000 células. Deu um índice de integridade do ácido ribonucleico de 6,7.
Q-R-T-P-C-R para o gene doméstico Beta actina forneceu valores de limiar do ciclo variando de 17 a 19. A avaliação por bioanalisador das bibliotecas de sequenciamento construídas a partir de 50 nanogramas de ácido ribonucleico total mostrou um pico característico entre 300 e 500 pares de bases. O sequenciamento de RNA dessas bibliotecas gerou dados de alta qualidade com escores Q 20 e Q 30, ultrapassando 90% e baixa taxa de erro entre réplicas.
Uma consideração importante é prevenir a antidegradação por meio de cessação do controle, manchagem rápida e condições retas durante nosso processamento. Ordenando esse procedimento, ele pode ser usado para PCR em tempo real e sequenciamento com chaves de biblioteca otimizadas para fragmentação. Estabelecido em amostras de fígado.
Esse protocolo permite o perfil de subgrupos de hepatócitos e apoia pesquisas hepatológicas focadas em patologia.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para microdissecção a laser (LCM) e extração de RNA de cortes de fígado de camundongo embutidos em OCT e fixados com paraformaldeído (PFA). O método permite o isolamento de regiões histológicas específicas para análises transcritômicas subsequentes, garantindo alta pureza e integridade do RNA, adequadas para aplicações sensíveis como qPCR e sequenciamento de RNA.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Hepatologia
- Biologia Molecular
- Histologia
Contexto
- Doenças hepáticas crônicas frequentemente exigem análise molecular com resolução espacial de subpopulações de hepatócitos.
- Métodos tradicionais de inclusão em parafina (FFPE) podem comprometer a integridade do RNA, limitando aplicações posteriores.
- A microdissecção a laser (LCM) permite o isolamento preciso de populações celulares definidas em tecidos complexos.
- A fixação com PFA e inclusão em OCT preservam a morfologia tecidual e a qualidade do RNA para estudos transcriptômicos.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo robusto para o isolamento de populações específicas de células hepáticas utilizando microdissecção a laser a partir de tecido fixado em PFA e embutido em OCT.
- Extrair RNA de alta qualidade adequado para análise transcriptômica a partir de amostras em escala microscópica.
- Validar a eficácia do protocolo para aplicações posteriores, como qPCR e sequenciamento de RNA.
Métodos Utilizados
- Preparação de lâminas de membrana PEN com exposição a UV e revestimento com poli-L-lisina.
- Crioseção de fígado de camundongo fixado com PFA e embutido em OCT a -20°C.
- Coloração com hematoxilina e manipulação livre de RNase em todo o fluxo de trabalho.
- Microssesão a laser de regiões definidas histologicamente (aproximadamente 1.000 células).
- Extração, quantificação e avaliação da qualidade do RNA (razão A260/A280, RIN, eletroforese em gel).
- Validação posterior por qPCR para β-actina e sequenciamento de RNA com preparação de biblioteca otimizada para fragmentação.
Resultados Principais
- Os rendimentos de RNA de 1.000–2.000 células variaram de 110,7 a 213,3 ng.
- A pureza do RNA foi alta (A260/A280: 1,9–2,1).
- O número de integridade do RNA (RIN) foi em média 6,7 ± 0,9, compatível com fixação em PFA.
- A qPCR para β-actina mostrou valores de Ct de 17–19, indicando boa qualidade do RNA.
- As bibliotecas de RNA-seq apresentaram picos característicos (300–500 pb) e mais de 90% das bases nos limiares de qualidade Q20/Q30.
Conclusões
- Este protocolo permite uma análise precisa e com resolução espacial da expressão gênica em tecido hepático.
- O RNA extraído possui pureza e integridade suficientes para aplicações sensíveis em etapas subsequentes.
- O método possibilita o perfilamento de subgrupos de hepatócitos e pesquisas em hepatologia com foco em patologias.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microdissecção a laser (LCM) de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído e embutido em OCT permite o perfilamento transcriptômico com resolução espacial de populações celulares definidas, apoiando a desmistificação mecanicista na fase inicial de descoberta. Esta abordagem fornece RNA de alta pureza adequado para análises downstream sensíveis, facilitando a validação confiável de alvos e a investigação de vias relevantes para doenças. O protocolo aborda um ponto crítico de inflexão para portfólios de P&D voltados à hepatologia e à patologia que buscam insights moleculares robustos e específicos de região.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação espacialmente precisa de subgrupos de hepatócitos em tecido hepático complexo.
- Apoia a validação funcional de alvos ao isolar regiões definidas histologicamente para análise de RNA.
- Facilita a desmistificação mecanicista ao associar assinaturas moleculares a características patológicas específicas.
- Melhora a confiança preditiva para triagem de portfólios ao fornecer dados de RNA de alta qualidade e específicos de região.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara amostras biológicas validadas para fluxos de trabalho downstream de qPCR e sequenciamento de RNA.
- Garante a reprodutibilidade dos ensaios por meio do processamento padronizado de tecidos e métricas de qualidade de RNA.
- Fornece resultados quantitativos (por exemplo, valores de Ct, integridade de RNA) para avaliação confiável de compostos.
- Permite a reutilização da plataforma para múltiplas aplicações transcriptômicas em modelos de doenças hepáticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha o perfil molecular com a histopatologia relevante para a doença na descoberta translacional de biomarcadores.
- Mantém a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, apoiando análises sensíveis baseadas em RNA.
- Reduz o risco biológico nas decisões de avanço pré-clínico, garantindo a integridade da amostra e a qualidade dos dados.
- Apoia pesquisas orientadas por patologia em modelos de doenças hepáticas crônicas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de LCM integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a análise direcionada da expressão gênica em cortes de tecidos fixados, conectando a avaliação histológica e os resultados moleculares.
- Biologia da Descoberta: Fornece testes de hipóteses com resolução espacial e esclarecimento de vias em tecido hepático.
- Triagem: Gera saídas quantitativas reprodutíveis de RNA para desenvolvimento e validação de ensaios.
- Análises: Fornece RNA de alta pureza e métricas robustas de qualidade (A260/A280, RIN, valores de Ct) para análises comparativas.
- Pesquisa Translacional: Conecta características histopatológicas a perfis transcriptômicos para alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho reutilizável para transcriptômica espacial em modelos de tecido fixado.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras e a extração de RNA para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/interromper e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas para doenças hepáticas.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em criosseccionamento, coloração histológica e uso de instrumentos de microdissecção a laser (LCM).
- Requer acesso a instalações livres de RNase e infraestrutura analítica para avaliação da qualidade do RNA.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de processamento de tecidos e extração de RNA.
- Pode exigir adaptação para outros tipos de tecidos ou modelos de doenças, com validação prévia.
- A integridade do RNA é inerentemente limitada pela fixação com PFA, mas permanece adequada para qPCR e RNA-seq.
