Microdissecação por captura a laser de tecido hepático de camundongo fixado com paraformaldeído para análise de RNA

Nossa pesquisa investiga principalmente a fisiopatologia relacionada a hepatócitos no contexto de doenças crônicas do fígado. Esse protocolo permite o isolamento celular em fatias de tecido hepático e a extração de RNA. Ao contrário do FFPE, ou protocolo Paraformaldeído fixo ou CT, preserva e itegrida, permitindo uma microanálise precisa e amostras de alta qualidade para análise OMI a jusante.

Para começar, expor as lâminas de membrana da caneta à luz ultravioleta em quatro minutos e meia. Cubra as lâminas com 0,1 miligrama por mililitro de polilisina L e deixe-as secarem ao ar. Sele as bordas de cada ferrolho com um meio de montagem neutro.

Usando um agente de descontaminação de RNase, limpe todas as superfícies acessíveis do criostato e todas as ferramentas. Usando 75% de etanol. Limpe bem a escova e as ferramentas.

Agora, ajuste a temperatura do criostato para menos 20 graus Celsius e deixe estabilizar. Retire as amostras de fígado do armazenamento a menos 80 graus Celsius. Coloque as amostras na câmara do criostato por pelo menos 15 minutos para se equilibrar.

Aplique uma camada de composto OCT de dois a três milímetros de espessura sobre a etapa da amostra. Depois, coloque a etapa da amostra em uma prateleira livre rápida ou dentro da câmara do criostato para pré-solidificar a camada composta. Após aplicar uma pequena quantidade de composto OCT sobre a camada pré-solidificada, coloque o bloco de tecido equilibrado horizontalmente sobre o composto e mantenha-o no lugar por 10 a 15 segundos.

Em seguida, montar o estágio da amostra com o bloco de tecido acoplado na cabeça da amostra criostatica. Agora insira a lâmina cuidadosamente entre as placas de fixação e as placas traseiras de um lado do criostato. Prenda a alavanca de fixação para fixar a lâmina.

Ajuste a espessura do criostato para 10 micrômetros. Corte o tecido em seções e monte-as diretamente sobre as lâminas de membrana pré-tratadas dentro da câmara do criostato, mantidas a menos 20 graus Celsius. Descongele os slides em temperatura ambiente por 20 minutos.

Lave os slides três vezes com PBS livre de RN ACE quatro vezes em cada lavagem de 10 segundos. Adicione a solução filtrada de hematoxilina de Mayer nas seções do tecido por cinco a dez segundos. Depois, lave as lâminas três vezes com água sem ribonuclease por 10 segundos a cada lavagem para remover a hematoxilina residual.

Avalie a qualidade da coloração ao microscópio. Usando papel absorvente, seque as lâminas e deixe secar completamente ao ar. Limpe a superfície da bancada de laboratório com agente de descontaminação RNase.

Ligue o controlador e permita que o microscópio complete a inicialização. Gire a tecla no sentido horário da posição desligada para a posição ligada para iniciar o sistema laser. Ligue o computador e inicie o software de microdissecação de captura a laser.

Depois, aguarde a inicialização ser concluída. Agora insira um tubo PCR estéril de 0,2 mililitros no dispositivo de coleta. Usando uma pipeta, adicione 10 microlitros de protease K tampão de digestão na tampa do tubo de PCR.

Carregue o dispositivo de coleta no suporte para amostras do microscópio. Na janela do dispositivo coletor de alterações. Vá para ajustar o ponto de referência, ajuste o foco da câmera para visualizar claramente o ponto de referência e use os controles de seta para centralizá-lo se necessário.

Carregue uma seção de tecido no suporte da amostra com o tecido voltado para baixo e a posição do rótulo à direita. Selecione a lente objetiva 10 x e identifique regiões de interesse com características patológicas específicas. Navegue até o menu laser.

Clique em calibrar, selecione sim e complete a calibração. No painel de controle do laser, ajuste a potência do laser para 50, abertura para cinco e velocidade para nove. Depois, use a barra de ferramentas gráfica para desenhar um círculo ao redor da área de destino.

Selecione uma única forma, pressione start cut para realizar microdissecação de captura a laser e posicione o dispositivo de coleta para coletar o tecido dissecado. Para capturar documentação, imagens, selecione o arquivo e escolha salvar imagens para salvar imagens antes e depois no formato preferido. Após coletar as células desejadas, clique em descarregar para remover o coletor do palco.

Verifique se 10 microlitros de protease K tampão de digestão permanecem na tampa e reabasteça se necessário. Feche o tubo e faça um vórtice completo. Depois, gire o tubo brevemente em uma centrífuga.

Armazene o tubo a menos 80 graus Celsius até a extração de RNA. A seção hepática colorida com hematoxilina na lâmina da caneta foi visualizada ao microscópio antes e depois da microdissecção por captura a laser. Regiões de interesse que apresentam esteatose microvesicular foram coletadas com precisão na tampa do tubo A de PCR.

Preservando a morfologia celular intacta. O ácido ribonucleico total extraído de aproximadamente 1000 e 2000 células isoladas de microdissecação por captura a laser produziu 110,7 nanogramas e 213,3 nanogramas, respectivamente. Todas as amostras apresentaram alta pureza com razões de absorção de 260 por 280 nanômetros entre 1,9 e 2,1.

A eletroforese em gel revelou bandas distintas de ácido ribossomal 28 s e 18 s. Perfis de bioanalisadores de ácido ribonucleico de apenas 1000 células. Deu um índice de integridade do ácido ribonucleico de 6,7.

Q-R-T-P-C-R para o gene doméstico Beta actina forneceu valores de limiar do ciclo variando de 17 a 19. A avaliação por bioanalisador das bibliotecas de sequenciamento construídas a partir de 50 nanogramas de ácido ribonucleico total mostrou um pico característico entre 300 e 500 pares de bases. O sequenciamento de RNA dessas bibliotecas gerou dados de alta qualidade com escores Q 20 e Q 30, ultrapassando 90% e baixa taxa de erro entre réplicas.

Uma consideração importante é prevenir a antidegradação por meio de cessação do controle, manchagem rápida e condições retas durante nosso processamento. Ordenando esse procedimento, ele pode ser usado para PCR em tempo real e sequenciamento com chaves de biblioteca otimizadas para fragmentação. Estabelecido em amostras de fígado.

Esse protocolo permite o perfil de subgrupos de hepatócitos e apoia pesquisas hepatológicas focadas em patologia.