Um Protocolo para Colheita de Suspensão de Célula Única de Córneas de Camundongos
3 de abril de 2026
Aqui, apresentamos um protocolo para obter suspensões unicelulares de alta qualidade de córneas inteiras de camundongo por meio da digestão sequencial com colagênase A e tripsina. Esse método gera células únicas viáveis com alta integridade de RNA, tornando-as compatíveis com aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA de célula única e citometradorde fluxo y.
Esse protocolo introduz principalmente um método para obter células individuais de alta qualidade a partir de córneas de camundongos intactas. Nosso método é uma célula única viável com alta integridade de RNA, tornando-as compatíveis com aplicações a jusante, como célula única em uma célula espessa e fina e diametro de fluxo. Para começar, posicione uma fêmea de camundongo C57BL6 eutanasiada de seis a oito semanas sobre uma mesa de dissecação estéril.
Após enxaguar as pálpebras fechadas com PBS, use uma tesoura oftálmica para fazer uma incisão ao longo do polo posterior do globo ocular e coloque cuidadosamente o olho isolado em uma placa de Petri contendo meio epitelial hormonal suplementar gelado. Após enxaguar o globo ocular três vezes com 1XPBS suplementado com estreptomicina 5% de penicilina, use tesoura oftálmica e pinças para fazer uma incisão do polo posterior em direção ao limbo corneano. Desprenda suavemente a córnea da esclera e conjuntiva ao longo da borda limbal e, usando dois pares de pinças, remova completamente o cristalino e a íris.
Após lavar o tecido corneano três vezes em PBS, transfira o tecido limpo para um novo tubo. Adicione um mililitro de cinco miligramas por solução de colagênase A e triture o tecido em fragmentos de aproximadamente 0,5 por 0,5 milímetros usando tesoura oftálmica. Incube o tubo contendo os fragmentos corneanos com solução de colagênase A em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por uma hora.
Inspecione o tecido a cada 10 minutos durante a digestão. Quando não restam grandes fragmentos de tecido, centrifuge a amostra a 300G por cinco minutos em temperatura ambiente, depois aspire cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet em 200 microlitros de solução de tripsina EDTA a 0,25%.
Coloque o tubo em uma incubadora de cultura celular ajustada a 37 graus Celsius por 10 minutos para digerir os fragmentos de tecido restantes. Por fim, use uma pipeta P1000 equipada com uma ponta de diâmetro largo para triturar suavemente a mistura e obter uma suspensão de célula única. Centrifuge a suspensão da célula como demonstrado anteriormente e resuspenda o pellet da célula em PBS contendo 0,04% de BSA.
Ao contar as células corneanas isoladas usando um hemocitômetro, constatou-se que um total de 1,05 vezes 10 elevado à potência de cinco células foi obtido de oito córneas com uma viabilidade celular média de 94,6% e uma proporção de células únicas superior a 96,3%, confirmando a adequação da suspensão para aplicações posteriores. A análise de imunofluorescência mostrou que a suspensão celular compreendia 83,5% de células epiteliais pan-CK positivas, 13,5% de células estromais positivas para ceratocano e aproximadamente 3% de células negativas para ambos os marcadores. O RNA extraído da suspensão unicelular apresentou um alto índice de integridade de RNA de cerca de 8,8 e uma razão ribossomal de RNA de 28S por 18S de cerca de 2,15, confirmando excelente qualidade do RNA.
Após obter células individuais, podemos caracterizar a função das células corneanas e a exploração da marca superficial. Essa área é o estudo das interações célula a célula. Um desafio nesse método é praticamente separar a córnea de outros tecidos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo robusto para o isolamento de suspensões de células únicas de alta qualidade a partir de córneas inteiras de camundongos. O método combina a dissecação precisa do tecido com digestão enzimática sequencial, permitindo o preparo de células viáveis adequadas para aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) e citometria de fluxo. O protocolo fornece altos números de células, excelente viabilidade e preserva a integridade do RNA, facilitando a análise detalhada da heterogeneidade celular da córnea.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Oftalmologia
- Biologia Celular
- Análise de Célula Única
Contexto
- A córnea é a camada mais externa do olho, essencial para a visão e para a homeostase da superfície ocular.
- A sequenciação de RNA de única célula (scRNA-seq) exige suspensões de células isoladas de alta qualidade.
- O tecido corneano é denso e complexo, o que torna a dissociação celular desafiadora.
- Protocolos existentes frequentemente apresentam baixa viabilidade celular ou má qualidade do RNA.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo confiável para gerar suspensões de células únicas a partir de córneas de camundongo intactas.
- Garantir alta viabilidade celular e integridade do RNA para aplicações posteriores.
- Permitir a identificação e quantificação precisas dos principais tipos celulares da córnea.
Métodos Utilizados
- Dissecação de córneas de camundongos C57BL6 eutanasiados.
- Digestão enzimática sequencial utilizando colagenase A e tripsina-EDTA.
- Minuciona mecânica e trituração suave para obter suspensão de células isoladas.
- Avaliação da viabilidade celular com coloração por azul de tripano e contagem em hemocitômetro.
- Coloração por imunofluorescência para Pancytokeratin (células epiteliais) e Keratocan (células estromais).
- Análise da integridade do RNA utilizando um bioanalisador.
Resultados Principais
- Obteve-se aproximadamente 1,05 × 105 células de oito córneas.
- Alta viabilidade celular (94,6%) e proporção de células individuais (96,3%).
- Composição celular: 83,5% de células epiteliais positivas para pan-CK, 13,5% de células estromais positivas para queratocana, cerca de 3% negativas para ambos os marcadores.
- Número de integridade do RNA (RIN) de cerca de 8,8 e razão do rRNA 28S/18S de aproximadamente 2,15, indicando excelente qualidade do RNA.
Conclusões
- O protocolo produz com confiabilidade suspensões de células únicas de alta qualidade a partir de córneas de camundongo.
- Os preparos celulares são adequados para aplicações downstream exigentes, incluindo sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq).
- Este método facilita estudos detalhados da função celular corneana e das interações entre células.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Suspensões de alta qualidade de células individuais provenientes de córneas de camundongos são essenciais para o avanço da pesquisa oftálmica em fase de descoberta e para o perfilamento celular de alta resolução. Este protocolo aborda um gargalo crítico no preparo de células únicas viáveis e com RNA intacto a partir de tecidos oculares densos, impactando diretamente a confiabilidade das análises de célula única em etapas subsequentes. A preparação robusta de células aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e apoia a continuidade translacional entre as fases de descoberta e pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da heterogeneidade celular da córnea com resolução em nível de única célula.
- Apóia a validação funcional de alvos ao preservar a viabilidade celular e a integridade do RNA.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio da identificação precisa de tipos celulares.
- Melhora a confiança preditiva na seleção precoce de alvos oftálmicos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece suspensões padronizadas de células isoladas com alta viabilidade para o desenvolvimento de ensaios.
- Garante reprodutibilidade e saída quantitativa para sequenciamento de RNA de célula única em etapas subsequentes.
- Prepara material biológico validado para fluxos de trabalho escalonáveis de triagem.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos sobre populações celulares corneanas distintas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para doenças ao preservar a diversidade nativa de células corneanas.
- Mantém a qualidade do RNA para a descoberta e validação de biomarcadores translacionais.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, garantindo continuidade dos dados desde a fase de descoberta até as etapas pré-clínicas.
- Reduz a ambiguidade biológica em estudos pré-clínicos oftálmicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se na interface entre a fase inicial de descoberta e a pesquisa pré-clínica, permitindo uma transição contínua da dissociação tecidual à análise de célula única e a estudos funcionais subsequentes.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir o perfilamento de alta fidelidade em nível de célula única.
- Triagem: Fornece suspensões quantitativas e reprodutíveis de células únicas prontas para ensaios e triagem de compostos.
- Análises: Oferece métricas robustas de viabilidade celular, quantificação de tipos celulares e integridade do RNA para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Preserva a diversidade celular e a qualidade do RNA para alinhamento de biomarcadores e validação pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado adaptável a diferentes programas de pesquisa oftálmica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Fornece preparações padronizadas, reprodutíveis e escalonáveis de células individuais.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de avançar/não avançar e melhora a eficiência do capital em P&D oftálmica.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos em estágio de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em dissecação de tecidos oculares e técnicas de digestão enzimática.
- Requer acesso a ensaios de viabilidade celular, imunofluorescência e instrumentação para análise de integridade de RNA.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade e comparabilidade dos dados.
- Pode ser adaptado a outros tipos de tecidos densos mediante otimização do protocolo.
- A precisão na separação dos tecidos é essencial para evitar contaminação e garantir a pureza da amostra.
