Teste de Neutralização de Redução de Fluorescência do Vírus Hepatite E para Medição de Títulos de Anticorpos Neutralizantes

O principal objetivo do teste de neutralização baseado em redução de fluorescência é quantificar o potencial de neutralização de um candidato a vacina e de anticorpos contra o HEV. A natureza citopática conhecida do HEV limita o ensaio PRND. Este protocolo foca no treinamento imunológico PRND, para visualizar células infectadas e, posteriormente, minerar — Para começar, contar as células HuH-7 recém-divididas.

Em seguida, coloque uma lâmina de cobertura de vidro de grau microscopico em uma placa de 12 poços e semeie 0,2 milhão de células por poço em um mililitro de DMEM completo suplementado com 10% de FBS. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, adicione 500 microlitros de mídia sem soro contendo 1,8 vezes 10 à potência de quatro cópias genômicas de g1-HEV purificado às células semeadas.

Incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Use 500 microlitros de DPBS para lavar as células três vezes. Adicione dois mililitros de DMEM suplementados com 2% de FBS aos poços.

Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Lave as células três vezes com 500 microlitros de DPBS, incubando por cinco minutos em temperatura ambiente entre cada lavagem. Adicione 500 microlitros com 4% de paraformaldeído às células e incube-as em temperatura ambiente por 20 minutos.

Depois, lave as células com DPBS, como demonstrado anteriormente. Após a lavagem final, incube-as em DPBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Adicione 250 microlitros de solução bloqueante contendo 5% de soro normal de cabra, 0,5% de albumina sérica bovina e 0,3% de Triton X100 em DPBS.

Incube em um shaker por uma hora em temperatura ambiente. Remova a solução bloqueante e lave uma vez com 500 microlitros de DPBS. Depois, adicione 250 microlitros de solução primária de anticorpos em uma diluição de um a 500.

Incube as células durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave as células com DPBS três vezes, como demonstrado anteriormente. Adicione 100 microlitros de anticorpo secundário com diluição de um para 1.000 e incube por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara humificada.

Realize o ciclo de lavagem e incubação como demonstrado anteriormente. Adicione 10 microlitros de reagente antifade com DAPI em uma lâmina de vidro. Monte o deslizamento da tampa com as células voltadas para o reagente evitando bolhas de ar.

Sele a capa com esmalte para preservá-la e visualizar a microscopia confocal. Conte células HuH-7 recém-divididas. Depois, coloque uma camada de cobertura de vidro grau microscopico em uma placa de 12 poços e semeie 0,2 milhão de células em um mililitro completo de DMEM por poço.

No dia seguinte, prepare uma diluição serial dez vezes maior de anticorpos anti-ORF2 e imunoglobulina G de coelho em meios sem soro, com uma concentração inicial de anticorpos de 25 microgramas por mililitro e até uma diluição final de 10 com potência de menos cinco. O volume final da diluição deve ser de 100 microlitros. Depois, adicione 1,8 vezes 10 à potência de quatro cópias genômicas de g1-HEV purificado a cada diluição de anticorpos.

Incube a mistura do vírus de anticorpos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Lave as células com 500 microlitros de DPBS. Adicione a mistura de anticorpos do vírus às células.

Incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Lave as células com um tampão de 500 microlitros. Após adicionar DMEM com 2% de FBS, incube por 72 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Processe as células para coloração imunofluorescente, como demonstrado anteriormente. Após adquirir as imagens de fluorescência, abra o software ImageJ. Selecione Arquivo e abra a imagem.

Depois, selecione Imagem, Tipo e clique em 8-bit para converter a imagem RGB para o formato 8-bit. Ajuste o limiar selecionando Imagem e escolhendo Ajustar, depois Limiar, definindo o nível inferior para 40 e o nível superior para 255. Selecione Analisar, escolha Analisar Partículas e ative Exibir resultados, Limpar resultados, Resumir, Excluir nas arestas e Compondo regiões de interesse.

Depois, clique em OK para obter a contagem de pontos fluorescentes. Calcule a porcentagem de neutralização e NT50 como o antilog de Log10 NT50, usando a fórmula fornecida. Plote o gráfico mostrando a média e o desvio padrão de todos os campos.

Um nível significativo de ácido ribonucleico g1-HEV foi detectado em células infectadas em comparação com células infectadas de forma simulada. Ensaio de imunofluorescência usando anticorpos anti-ORF2 confirmou a expressão de ORF2 nas células HuH-7 infectadas. O título de neutralização de 50% do anticorpo anti-ORF2 foi estimado em 2,1 vezes 10 elevado à potência de três.

Imagens representativas mostram o aparecimento de células HuH-7 infectadas simuladamente e infectadas por G1-HEV no teste de neutralização de redução de fluorescência. Esse protocolo permite que pesquisadores estudem o potencial de neutralização dos anticorpos anti-HEV e meçam seu título de neutralização de 50%. A etapa crítica desse protocolo é o isolamento do vírus infeccioso da hepatite E e a coloração celular adequada e aquisição de imagens de alta resolução.

Métodos alternativos como RT-qPCR e ELISA podem ser usados para determinar o título de neutralização, mas apresentam algumas limitações.