Name: Eletrofisiologia de Canal Único Utilizando um Sistema Miniaturizado de Bicamada Lipídica Plana de Montal–Mueller para Gravação de um Canal K2P Sintético (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprenda eletrofisiologia de canal único usando a plataforma miniaturizada BLMchipMM com amplificador compacto. Este método reduz consumo de reagentes e simplifica a análise funcional de canais iônicos sintéticos como ancTREK1.

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Agradecemos a Sofia Diletta Guzzeloni pela ajuda com o procedimento de transfeção celular. Somos gratos aos funcionários da Elements, Dra. Leon Juarez e Dra. Michelangelo Paci. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Medicina Molecular da Universidade de Pavia, Itália, no âmbito da iniciativa Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027), pela Fundação Cariplo (#2019-1809) e pelo Programa de Pesquisa PNRR CN00000013 “Centro Nacional de HPC, Big Data e Computação Quântica” concedido a M.L.

F.T. e A.P. são o CEO e um funcionário da Elements S.r.l., respectivamente. Todos os demais autores declaram não ter conflitos de interesses.

Neste estudo, utilizamos a técnica PLB para avaliar as propriedades eletrofisiológicas de um canal K2P sintético em nível de molécula única. Entre os diversos modelos lipídicos planares descritos na literatura científica, focamos na formação de membranas lipídicas bilaminares (BLMs), que são pintadas sobre uma abertura com diâmetro entre 50 e 140 µm, perfurada em uma superfície não polar vertical que separa dois compartimentos aquosos. Essa configuração permite simular o ambiente da membrana celular mantendo o controle sobre parâmetros experimentais, incluindo a preparação da membrana lipídica e a composição do eletrólito (por exemplo, força iônica e pH)3. Recriamos as BLMs utilizando o método de Montal–Mueller (por dobramento)5, no qual a membrana se autoorganiza espontaneamente quando duas monocamadas lipídicas, previamente espalhadas na interface ar–água das duas soluções aquosas, se unem sobre a abertura mediante o aumento do nível da água.
O protocolo apresentado aqui para a formação da membrana é altamente intuitivo; no entanto, várias etapas críticas influenciam fortemente o sucesso experimental. Para garantir uma conexão elétrica adequada entre o BLMchipMM e o amplificador, é essencial evitar a cloração das extremidades dos fios de Ag/AgCl que são inseridos nos conectores da PCB. Durante a montagem do BLMchipMM, o posicionamento inadequado dos fios pode resultar em contato com a carcaça do amplificador, levando a curtos-circuitos e saturação do sinal. O procedimento de pré-tratamento da abertura é outro fator crítico: a aplicação excessiva de força durante a aplicação da solução de pré-tratamento pode danificar o septo de poliimida, enquanto o manuseio inadequado da solução eletrolítica—especialmente molhar a região da abertura—pode comprometer a formação da membrana. Além disso, a limpeza cuidadosa da câmara de gravação do BLMchipMM é essencial para a reprodutibilidade. O uso de álcool isopropílico a 100%, seguido por enxágue completo e secagem total, garante que resíduos não interfiram em experimentos subsequentes.
Várias modificações ao protocolo são possíveis. Embora a cloração por imersão em água sanitária represente uma abordagem prática e amplamente utilizada, métodos alternativos, como a eletrodeposição, também podem ser empregados43. Da mesma forma, variações no pré-tratamento e na preparação dos lipídios são viáveis. As soluções padrão de pré-tratamento normalmente consistem em alcanos de cadeia longa dissolvidos em solventes hidrocarbonetos voláteis36; embora uma solução de 1% de hexadecano em n-hexano seja comumente usada, outros solventes podem ser adequados. A composição lipídica também pode ser adaptada conforme as necessidades experimentais. Embora os lipídios DPhPC proporcionem estabilidade ideal da membrana, misturas lipídicas alternativas, incluindo composições naturais ou sintéticas, podem ser utilizadas36. Uma vantagem importante das bicamadas lipídicas verticais formadas pelo método de dobramento é a capacidade de gerar membranas assimétricas, nas quais cada folheto é composto por espécies lipídicas diferentes5,22, uma característica conhecida por influenciar a função de proteínas de membrana.
O diagnóstico de problemas na formação da membrana geralmente envolve ajustes nos níveis da fase aquosa. Se a formação da membrana não ocorrer inicialmente, a diminuição e elevação repetidas do nível do tampão em um compartimento podem facilitar a montagem da bicamada. Se esse procedimento for infrutífero, a aplicação de uma bolha de ar sobre a abertura pode promover a redistribuição dos lipídios e a formação da membrana. A falha persistente geralmente indica problemas relacionados ao pré-tratamento ou à contaminação, caso em que se recomenda limpar a câmara de registro e reiniciar o experimento.
Os componentes principais deste sistema incluem o amplificador compacto eNPR de 100 kHz e o BLMchipMM. O amplificador é um sistema compacto de clamp de tensão com baixo ruído que elimina a necessidade de dispositivos externos adicionais, como gaiolas de Faraday externas, já que o próprio invólucro do amplificador fornece blindagem eletromagnética eficaz. O BLMchipMM é uma câmara de gravação miniaturizada e pré-montada, integrada a uma placa de circuito impresso (PCB) para conexão direta ao amplificador. Ele consiste em dois compartimentos em forma de C separados por um septo de poliimida com uma abertura cônica perfurada a laser, onde a membrana artificial é formada. As dimensões reduzidas do sistema, com volumes dos compartimentos de aproximadamente 110 µL, diminuem significativamente o consumo de reagentes e reduzem a capacitância intrínseca, melhorando assim a qualidade do sinal. Além disso, o dispositivo pode ser reutilizado várias vezes sem desmontagem, desde que os procedimentos adequados de limpeza sejam seguidos, reduzindo a variabilidade e aumentando a reprodutibilidade experimental.
Apesar dessas vantagens, algumas limitações devem ser consideradas. A configuração atual não inclui módulos integrados para controle de temperatura, pressão ou perfusão. Relatou-se que a tensão intrínseca da membrana influencia canais mecanossensíveis, como o TREK144,45,46; no entanto, a configuração atual não permite a manipulação controlada da tensão da membrana, e nenhuma conclusão mecanicista é feita aqui. De modo geral, esta plataforma fornece um sistema robusto e acessível para o registro da atividade de canais iônicos em membranas artificiais. Neste estudo, investigamos o canal K2P sintético ancTREK1, um canal ancestral derivado computacionalmente da subfamília TREK. Os dados registrados demonstram que o ancTREK1 purificado, quando reconstruído em BLPs, exibe comportamento de canal único consistente com as propriedades de condutância semelhantes às do TREK1 já descritas. Em condições simétricas de potássio 200 mM sem Mg2+, o canal exibe uma relação I–V mensurável, com valores de amplitude de aproximadamente 13 pA em 80 mV e −19 pA em −80 mV. Além disso, o ancTREK1 exibe o modo característico de alta condutância observado em canais TREK1, com condutância maior em potenciais negativos (~205,6 pS) em comparação com potenciais positivos (~112,8 pS). Notavelmente, o ancTREK1 mostra um NPo aumentado em potenciais positivos (0,78 em 80 mV) e um NPo reduzido em potenciais negativos (0,53 em −80 mV e 0,28 em −120 mV), diferindo das observações em configurações de "excised patch"42. Esses achados apoiam o uso deste sistema para o registro, como prova de princípio, da atividade de canais únicos de proteínas de membrana reconstruídas.

O reconstituição de canais iônicos em membranas bilitetárias artificiais, também conhecidas como membranas lipídicas negras (BLMs), é uma das técnicas estabelecidas para realizar a caracterização eletrofisiológica de canais iônicos no nível de única molécula1. As vantagens das BLMs decorrem de sua estrutura. De fato, uma bicamada lipídica planar (PLB) é criada dentro de um poro em uma superfície não polar, separando duas soluções líquidas. Assim, ao imitar uma membrana biológica, permite o registro da atividade de canais iônicos sob condições altamente controladas, incluindo a composição lipídica da membrana e as concentrações de eletrólitos ou compostos químicos, mantendo-se acessível por ambos os lados. Essa acessibilidade também permite que os canais iônicos sejam inseridos diretamente, por exemplo, a partir de uma solução micelar ou por fusão mediada por lipossomos2,3.
O primeiro sistema de membrana artificial descrito foi criado usando a técnica de pintura4, na qual uma gota de lipídios dissolvidos em um solvente orgânico não volátil é aplicada em uma pequena abertura com um pincel. A adição de uma solução aquosa em ambos os lados da abertura leva então à formação espontânea de uma bicamada lipídica. No entanto, uma desvantagem significativa desse método é a retenção de traços de solvente, o que pode afetar as propriedades da membrana. Para reduzir a quantidade de solvente orgânico residual nas bicamadas lipídicas, foi desenvolvido o método de dobramento5, permitindo a formação de BLMs “livres de solvente”. Nessa abordagem, uma solução lipídica em um solvente volátil é espalhada sobre a superfície da água para formar duas monocamadas, e ao elevar gradualmente o nível da fase aquosa acima da abertura, essas monocamadas lipídicas dobram-se sobre a abertura, formando uma bicamada. Contudo, embora a BLM resultante seja definida como livre de solvente, a formação bem-sucedida da bicamada exige o pré-tratamento da abertura com uma fina camada de solvente não volátil. O elemento central necessário para esses experimentos consiste em uma câmara de registro com dois compartimentos aquosos (geralmente denominados cis e trans), separados por um septo lipofílico com uma pequena abertura (diâmetro de 50–250 µm) (Figura 1). Eletrodos de prata/cloreto de prata (Ag/AgCl) são inseridos em cada compartimento. Quando imersos na solução eletrolítica, esses eletrodos estabelecem a conexão eletroquímica entre a bicamada lipídica e o equipamento de registro. Este último consiste em um amplificador de fixação de voltagem, que permite o controle preciso do potencial transmembranar e a medição simultânea das correntes iônicas que atravessam proteínas formadoras de poros incorporadas.
<img alt="Diagrama de canal iônico em bicamada lipídica; configuração de eletrofisiologia; análise dos estados fechado/aberto do canal." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig1.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Esquema da configuração de eletrofisiologia em bicamada lipídica planar (BLP). Um esquema dos componentes essenciais necessários para experimentos com BLP. A câmara de gravação consiste em dois compartimentos aquosos (cis e trans) separados por um septo lipofílico contendo uma abertura onde é formada uma bicamada lipídica. Eletrodos de cloreto de prata/prata (Ag/AgCl) são imersos na solução eletrolítica em cada compartimento. Um eletrodo aplica estímulos de tensão (por exemplo, formas de onda senoidal, quadrada ou triangular), enquanto o outro, mantido em terra, conecta-se a um conversor de corrente em tensão que transforma a corrente iônica em um sinal de tensão proporcional. O sinal é amplificado, opcionalmente filtrado, digitalizado e registrado para monitoramento e análise em tempo real. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
Outros métodos também foram estabelecidos para formar bicamadas lipídicas artificiais (BLMs). Entre eles, uma abordagem comum consiste em criar bicamadas lipídicas suspensas na ponta de uma pipeta para patch-clamp. Assim, o método de imersão da ponta6 permite a formação de uma bicamada lipídica livre de solvente suspensa na abertura de uma micropipeta de vidro com diâmetro de aproximadamente 4 µm, mergulhando-se repetidamente a ponta através de uma monocamada lipídica na interface ar-água, capturando assim uma única monocamada durante cada passagem. A técnica de patch-clamp também tem sido utilizada para medições de canais individuais em bicamadas lipídicas. Por exemplo, no método de excisão7, uma pipeta de vidro com diâmetro entre 10 e 80 µm é usada para selar uma membrana grande originalmente pintada sobre uma abertura em uma câmara de gravação. Alternativamente, o método de lipossomo-patch envolve o uso de um vesículo pré-formado, de tamanho nano a microscópico, como uma BLM livre de solvente8,9. Em particular, vesículas unilamelares gigantes têm sido amplamente utilizadas para gravações de canais individuais por meio de diferentes configurações de patch-clamp, incluindo os modos ligado à célula e excisão10,11.
Várias plataformas também surgiram para a formação paralela e automatizada de múltiplas bicamadas. Uma dessas abordagens é a técnica da bicamada de interface entre gotas (DIB, na sigla em inglês)12, na qual gotas aquosas são colocadas em uma mistura de lipídio e solvente. Nesse método, monocamadas lipídicas se montam espontaneamente ao redor das gotas, e a formação da bicamada ocorre quando duas gotas entram em contato. Em algumas configurações, as DIBs podem ser formadas sobre hidrogéis para melhorar a estabilidade da membrana13. Uma abordagem alternativa baseada na formação de DIB na ponta de uma pipeta de vidro é o método da bicamada de bolhas em contato (CBB, na sigla em inglês)14, no qual bolhas aquosas são introduzidas em uma fase oleosa usando duas micropipetas. Como na abordagem DIB, uma bicamada lipídica forma-se espontaneamente quando duas bolhas revestidas com lipídio são colocadas em contato. Outra plataforma é representada pelos sistemas de BLM em arranjo, que consistem em arranjos de poros bem definidos, em escala micro a nanométrica, organizados em um padrão de grade. Nessas plataformas, bicamadas lipídicas suspensas podem ser formadas manualmente — por meio de técnicas de pintura ou dobramento, ou pela ruptura de vesículas lipossomais15,16,17 — ou automaticamente pela injeção sequencial de soluções lipídicas e tampão, quando acopladas a estruturas de canais microfluídicos18,19.
Embora muitos métodos tenham sido desenvolvidos para formar bicamadas lipídicas sem solvente (BLMs), neste trabalho focamos no método de dobramento implementado em uma plataforma miniaturizada e integrada para investigar o comportamento de canais individuais de proteínas de membrana inseridas em uma bicamada lipídica artificial. Os experimentos foram realizados usando o sistema Elements, que consiste em dois componentes: o Leitor de Nanoporos Elements (amplificador eNPR) e o BLMchipMM (Figura 2A e Figura 2B). O primeiro é um amplificador compacto e de baixo ruído para potencial constante que simplifica o ambiente de trabalho ao formar uma unidade completa e independente, eliminando a necessidade de dispositivos externos adicionais. O BLMchipMM é um sistema pré-montado e miniaturizado projetado para a técnica de Montal–Mueller e atua como interface experimental. Ele consiste em uma câmara de gravação transparente de polimetilmetacrilato (PMMA) integrada a uma placa de circuito impresso (PCB), que inclui dois encaixes projetados para acomodar fios de Ag/AgCl que funcionam como eletrodos para conexão direta ao amplificador. A estrutura principal da câmara é composta por um septo de poliimida selado entre dois componentes transparentes de PMMA. O septo tem 50 µm de espessura, exceto em uma pequena região central (3,78 mm2), onde a espessura é reduzida para 25 µm para facilitar a formação da bicamada. No centro dessa região mais fina, uma abertura cônica é criada por perfuração a laser, o que aumenta a estabilidade mecânica da bicamada lipídica20,21. Quatro diâmetros de abertura (50, 75, 100 e 140 µm) estão disponíveis, permitindo o ajuste da capacitância da membrana (Tabela 1). Cada componente de PMMA possui uma cavidade em forma de C com volume de 110 µL, formando dois compartimentos fluidos em ambos os lados do septo de poliimida para conter a solução eletrolítica. Dois canais fluidos inclinados são perfurados em cada bloco de PMMA em lados opostos: um canal é usado para inserir o eletrodo de Ag/AgCl, enquanto o outro permite o ajuste manual do nível do tampão no reservatório por meio de pipetagem.
<img alt="Dispositivo microfluídico com compartimento modular; esquema mostra o lado de PMMA, eletrodos, PCB para análise." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Leitor de nanoporos Elements e sistema BLMchipMM integrados. (A) Fotografia mostrando o BLMchipMM inserido no encaixe dedicado do amplificador Leitor de Nanoporos Elements (eNPR). (B) Representação esquemática dos componentes do BLMchipMM, incluindo a câmara de gravação de polimetilmetacrilato (PMMA), o septo de politrimida contendo a abertura em escala microscópica e a placa de circuito impresso (PCB) com soquetes para eletrodos de Ag/AgCl e um encaixe para alinhamento da câmara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Diâmetro do orifício (µm)</td>
			<td>50</td>
			<td>75</td>
			<td>100</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Espessura do orifício (µm)</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capacitância típica da membrana (pF)</td>
			<td>20–40</td>
			<td>40–60</td>
			<td>60–90</td>
			<td>90–140</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Características dos formatos de abertura disponíveis para o BLMchipMM. Diâmetro do orifício, espessura da septa na região da abertura e valores típicos de capacitância da membrana para dispositivos BLMchipMM com aberturas de 50, 75, 100 e 140 µm. Os valores de capacitância da membrana são apresentados para bicamadas formadas a partir de lipídios de 1,2-difitanoil-sn-glicerol-3-fosfocolina.
Normalmente, as câmaras de gravação usadas em laboratórios são unidades caseiras ou dispositivos comercialmente disponíveis. No primeiro caso, a construção do sistema envolve a montagem de vários componentes e o desenvolvimento de um método confiável para criar a abertura na septa, o que pode limitar o acesso para muitos laboratórios. Mesmo quando dispositivos comerciais são utilizados, geralmente é necessária a integração manual de múltiplos componentes antes de cada experimento. Em contraste, o BLMchipMM vem pré-montado e não requer desmontagem entre experimentos para procedimentos de limpeza rotineira. A mesma unidade pode ser lavada e reutilizada em múltiplos experimentos sem comprometer a qualidade da formação da membrana, desde que os solventes utilizados sejam compatíveis com os materiais do dispositivo. Isso reduz a variabilidade dependente do usuário e minimiza o risco de vazamentos associados a elementos de vedação manuais. O uso de eletrodos externos de fio de prata, substituíveis e passíveis de recondicionamento, amplia ainda mais a vida útil do sistema, especialmente em condições experimentais que aceleram o consumo dos eletrodos.
Além disso, dispositivos caseiros frequentemente possuem volumes grandes de compartimentos, aumentando a quantidade de componentes biológicos e químicos necessários para os experimentos. Em contraste, a miniaturização do BLMchipMM permite a redução dos volumes experimentais, reduzindo significativamente o consumo de reagentes, proteínas e outros compostos. Isso é particularmente vantajoso ao trabalhar com proteínas de membrana de difícil expressão ou com baixo rendimento, ou quando o alto custo da síntese de compostos de teste aumenta o custo total dos experimentos. De forma importante, o BLMchipMM possibilita a formação de bicamadas com quantidade mínima de solvente e suporta configurações assimétricas de membranas, nas quais cada folheto pode ser composto por espécies lipídicas diferentes5,22, facilitando o estudo da função de proteínas de membrana em condições controladas.
Tradicionalmente, as medições de corrente são realizadas usando amplificadores projetados para experimentos de patch-clamp, que frequentemente exigem conexão a um digitizador separado para aquisição de dados e controle por meio de interfaces gráficas. Esses sistemas não são apenas volumosos e caros, mas também geralmente envolvem procedimentos de configuração pouco intuitivos para usuários não especializados. Além disso, devido ao tamanho da câmara de gravação e ao design dos amplificadores padrão — que normalmente não possuem blindagem embutida para proteger a entrada do estágio inicial contra interferência eletrostática — o uso de uma gaiola de Faraday externa é muitas vezes necessário. A qualidade e o aterramento dessa gaiola podem afetar significativamente o desempenho do sistema em termos de ruído. O BLMchipMM, quando usado com um amplificador integrado compacto, simplifica essa configuração ao reduzir a necessidade de componentes externos. A digitalização do sinal ocorre dentro do próprio dispositivo, e o invólucro do sistema fornece blindagem que reduz a suscetibilidade à interferência eletromagnética ambiente.
Para demonstrar a aplicabilidade desta plataforma, o canal semelhante a K2P ancTREK1, um membro ancestral derivado computacionalmente da subfamília TREK (Figura Suplementar 1), foi utilizado como proteína-teste para validar o sucesso da reconstrução e da gravação de canais individuais. Os canais K2P formam canais de vazamento de potássio diméricos que regulam o potencial de membrana em repouso e a excitabilidade celular, sendo os canais TREK uma subfamília bem caracterizada.

<table><tbody><tr><td>1,2-difitanoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>Formação de bicamadas lipídicas artificiais</td></tr><tr><td>2-Propanol (&amp;ge;99,5%)</td><td>Honeywell</td><td>24137-5L</td><td>Limpeza do dispositivo BLMchipMM</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Preparação de géis de agarose</td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese horizontal em gel de agarose</td><td>BTLabSystems</td><td>BT102</td><td>Separacão de fragmentos de DNA</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1760-25</td><td>Seleção de bactérias transformadas</td></tr><tr><td>Resina de Sepharose com nanocorpo anti-GFP (caseira)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Purificação por afinidade de proteínas marcadas com GFP</td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina Anza</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2208</td><td>Desfosforilação de vetor</td></tr><tr><td>Anza EcoRI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0116</td><td>Digestão por restrição</td></tr><tr><td>Anza NotI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0014</td><td>Digestão por restrição</td></tr><tr><td>Tampão vermelho Anza (10&amp;times;)</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2008</td><td>Tampão para digestão por restrição</td></tr><tr><td>Inibidor de protease aprotinina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15996008</td><td>Prevenção da degradação proteica</td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>EP5420000164</td><td>Pelotização celular e preparação de amostras</td></tr><tr><td>BLMchipMM</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Formação de bicamadas lipídicas planares</td></tr><tr><td>Hemissuccinato de colesterol (CHS)</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>Estabilização de proteínas de membrana</td></tr><tr><td>Azul brilhante de Coomassie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1125530025</td><td>Coloração de proteínas</td></tr><tr><td>Água sanitária doméstica comum</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Cloração de fios de Ag</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>Redução da viscosidade do lisado</td></tr><tr><td>Água bidestilada</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Preparação de tampões e soluções</td></tr><tr><td>Etanol (puro, 99,9%)</td><td>Girelli Alcool s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Limpeza de fios de Ag/AgCl</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1116080030</td><td>Coloração de DNA</td></tr><tr><td>Papel de lixa de grão extrafino</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Remoção do revestimento de Ag/AgCl dos fios</td></tr><tr><td>Amplificador eNPR 100 kHz</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Registros eletrofisiológicos</td></tr><tr><td>Kit Gel-Out para extração de DNA de agarose</td><td>A&amp;amp;A Biotechnology</td><td>023-250</td><td>Purificação de DNA</td></tr><tr><td>Escada de DNA GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>Referência de tamanho de DNA</td></tr><tr><td>FreeStyle&amp;trade; 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>Expressão da proteína ancTREK1</td></tr><tr><td>HEPES (&amp;ge;99,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Agente tampão</td></tr><tr><td>Hexadecano (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6703-100ML</td><td>Pré-tratamento de aberturas</td></tr><tr><td>Hexano (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386-100ML</td><td>Solvente lipídico</td></tr><tr><td>Corante de carregamento de DNA 5&amp;times; caseiro</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Preparação de amostras de DNA</td></tr><tr><td>Tampão SDS Laemmli 6&amp;times; caseiro (redutor)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Preparação de amostras proteicas</td></tr><tr><td>Solução de descoloração caseira</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Descoloração de géis SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Protease HRV-3C caseira</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Clivagem de proteínas de fusão</td></tr><tr><td>Tampão de corrida SDS-PAGE 10&amp;times; caseiro</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Tampão para eletroforese SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10221</td><td>Eluição de proteínas com marcação His</td></tr><tr><td>Colunas de purificação em lote</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Fluxos de trabalho de purificação proteica</td></tr><tr><td>Incubadora agitadora Innova44</td><td>New Brunswick Innova</td><td>M1282</td><td>Cultivo de culturas celulares</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>31248-1KG</td><td>Preparação de eletrólito e tampão</td></tr><tr><td>Caldo LB (Lennox)</td><td>Condalab</td><td>1231</td><td>Cultura bacteriana</td></tr><tr><td>Inibidor de protease leupeptina</td><td>Thermo Scientific</td><td>78435</td><td>Prevenção da degradação proteica</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexaidratado</td><td>Acros Organics</td><td>447700010</td><td>Componente do tampão</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Nanodrop</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td>Quantificação de DNA e proteínas</td></tr><tr><td>n-Dodecil-&amp;beta;-D-maltosídeo (DDM)</td><td>NeoBiotech</td><td>NB-19-0056-25G</td><td>Solubilização de proteínas de membrana</td></tr><tr><td>Resina Ni Sepharose High Performance</td><td>Cytiva</td><td>17526801</td><td>Purificação IMAC</td></tr><tr><td>Computador portátil</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Controle de instrumento e aquisição de dados</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima LE-80K</td><td>Beckman</td><td>365668</td><td>Isolamento de fração de membrana</td></tr><tr><td>Pentano (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236705-100ML</td><td>Solvente lipídico</td></tr><tr><td>Inibidor de protease pepstatina A</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>Prevenção da degradação proteica</td></tr><tr><td>Tampão Phusion GC (5&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F519</td><td>Tampão para PCR</td></tr><tr><td>Polimerase de DNA de alta fidelidade Phusion</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Amplificação por PCR</td></tr><tr><td>Inibidor de protease PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Proteção proteica durante a lise</td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Clinisciences</td><td>24765-100</td><td>Reagente de transfeção</td></tr><tr><td>Gel pré-moldado ProteinEle Tris-Glicina (4&amp;ndash;20%)</td><td>TransGen Biotech</td><td>DG101-01-V2</td><td>Separacão de proteínas</td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese em gel SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658002FC</td><td>Eletroforese proteica</td></tr><tr><td>Butirato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11079</td><td>Potencializador da expressão proteica</td></tr><tr><td>Ligase de DNA T4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>Ligação de DNA</td></tr><tr><td>Tampão de ligase de DNA T4 (10&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B69</td><td>Tampão de ligação</td></tr><tr><td>Ciclador térmico (Mastercycler Nexus)</td><td>Eppendorf</td><td>6331000025</td><td>Amplificação por PCR</td></tr><tr><td>Base de Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td>Preparação de tampão</td></tr><tr><td>Ágar triptona SOYA com lecitina e polissorbato 80</td><td>HiMedia</td><td>M449-5KG</td><td>Plaqueamento bacteriano</td></tr><tr><td>Dois fios de Ag</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Elétrodos para eletrofisiologia</td></tr><tr><td>Concentrador ultracentrífugo (corte de 50 kDa)</td><td>Merck Amicon</td><td>UFC8050</td><td>Concentração de proteínas</td></tr><tr><td>Vetor de expressão pEG BacMam</td><td>Addgene</td><td>160687</td><td>Expressão proteica</td></tr><tr><td>Cabo USB</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Conexão entre amplificador e computador</td></tr></tbody></table>

eletrofisiologia de canal Único utilizando um sistema miniaturizado de bicamada lipídica plana de montal–mueller para gravação de um canal k2p sintético

Single-Channel Electrophysiology Using a Miniaturized Montal&#8211;Mueller Planar Lipid Bilayer System for Recording a Synthetic K2P Channel

O reconstituição funcional de canais iônicos em bicamadas lipídicas planares fornece uma estratégia para investigar a atividade do canal em nível de molécula única. No entanto, os sistemas convencionais de bicamada de Montal–Mueller normalmente exigem configurações experimentais volumosas, montagem manual da câmara e volumes relativamente grandes de gravação, o que aumenta o consumo de reagentes e pode introduzir fontes adicionais de ruído elétrico devido à fiação prolongada e estágios externos. Aqui, apresentamos uma plataforma de bicamada miniaturizada e pronta para uso (BLMchipMM) integrada a um amplificador compacto que permite gravações estáveis de canal único com redução no consumo de reagentes e operação simplificada. Este protocolo descreve o uso desse sistema para realizar medições de eletrofisiologia de canal único. Utilizando este sistema, reconstituímos um canal K2P sintético (ancTREK1) e o utilizamos como proteína-teste de prova de princípio para validar a reconstituição e a gravação de canal único. As gravações de canal único mostram uma relação corrente–voltagem em soluções simétricas de K+ livres de Mg2+, com valores de condutância consistentes com os relatados para canais TREK1. A reconstituição bem-sucedida deste canal semelhante a K2P demonstra a utilidade deste sistema para análise de canal único em membranas artificiais.

Características corrente–tensão (I–V) de membranas PLB
A natureza hidrofóbica intrínseca das membranas bicamada as torna impermeáveis a espécies carregadas. No entanto, a aplicação de um campo elétrico externo pode induzir a formação de poros transitórios de tamanho nanométrico, afetando assim a permeabilidade e a condutância da membrana33. Para avaliar a qualidade das bicamadas artificiais formadas a partir de lipídios de 1,2-difitanoil-sn-glicerol-3-fosfocolina, a capacitância, a resistência e as características I–V da membrana foram avaliadas na ausência de proteínas inseridas. Uma série de degraus de tensão variando de ±20 a ±200 mV (em incrementos de ±20 mV) foi aplicada, e as correntes transmembrana resultantes foram registradas. Os dados foram amostrados a 5 kHz e filtrados passa-baixa em 2,5 kHz.
A capacitância da membrana (Cm) e a resistência da membrana (Rm) representam parâmetros-chave para avaliar a qualidade da bicamada. A PLB pode ser descrita por um circuito equivalente resistor–capacitor (RC), no qual a membrana se comporta como um capacitor em paralelo com um resistor34. O componente capacitivo reflete a capacidade da membrana de armazenar carga, enquanto o componente resistivo reflete a permeabilidade a íons. A aplicação de uma forma de onda de tensão triangular gera uma resposta de corrente capacitiva com formato quadrado, que é proporcional à capacitância da membrana segundo:
<img alt="Fórmula da corrente capacitiva I_c=C_m(dv/dt), ilustrando a análise de circuitos elétricos." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Equação 1">    (1)
Aqui, Cm é a capacitância da membrana, V é a tensão aplicada e t é o tempo. Após a formação da membrana, os valores de capacitância podem aumentar ao longo do tempo devido ao adelgaçamento progressivo da bicamada35. Considerando a membrana como um capacitor de placas paralelas, a capacitância relaciona-se com a área e a espessura da membrana segundo:
<img alt="Fórmula da capacitância com lipídios, equação, diagrama educacional, constante dielétrica." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Equação 2">    (2)
Aqui, εlipids é a constante dielétrica do núcleo lipídico (~2), ε0 é a permissividade do espaço livre, A é a área da membrana e d é a espessura da membrana36,37.
A resistência da membrana foi determinada usando a lei de Ohm33:
<img alt="Equação da força eletromotriz Ir=V/Rm, diagrama educacional para resistência elétrica." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Equação 3">    (3)
Aqui, V é a tensão aplicada e Rm é a resistência da membrana. Na ausência de canais iônicos, a corrente da membrana permanece próxima de 0 pA, correspondendo a valores de resistência na faixa de giga-ohm (GΩ)33.
A relação I–V exibiu comportamento linear (ôhmico) entre 0 e ±200 mV para dispositivos BLMchipMM com aberturas de 75 e 100 µm. O ajuste linear dos dados forneceu valores de resistência da membrana de 847 ± 16 GΩ (n = 6) para a abertura de 75 µm (Figura 8A, círculos) e 980 ± 32 GΩ (n = 7) para a abertura de 100 µm (Figura 8A, quadrados). Os valores de ruído RMS, medidos em segmentos de 3 s do traçado da corrente, foram de 3,1 ± 2 pA (n = 7) para a abertura de 100 µm e 2,6 ± 0,1 pA (n = 6) para a abertura de 75 µm. A estabilidade da membrana foi avaliada mediante medição da resistência em intervalos de aproximadamente 2 min durante um período total de 1 h (Figura 8B). Membranas bem formadas permaneceram consistentemente estáveis por mais de 1 h, o que é suficiente para a maioria dos experimentos eletrofisiológicos. As membranas geralmente toleraram potenciais aplicados até ±200 mV sem sinais de instabilidade, enquanto a ruptura ocorreu entre ±220 e ±300 mV, dependendo da bicamada individual. Considerou-se que as membranas eram adequadas para inserção de proteínas quando os valores de capacitância variavam de 40 a 60 pF para aberturas de 75 µm e de 60 a 90 pF para aberturas de 100 µm, com valores de corrente de ≤0,5 pA a 100 mV.
<img alt="Gráficos de tensão-corrente e resistência-tempo, estudo com chip de membrana bicamada, resultados da análise de dados." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig8.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 8"> 
Figura 8: Caracterização elétrica de bicamadas planares (PLBs). (A) Relações corrente–tensão (I–V) de bicamadas formadas em aberturas de 75 µm e 100 µm, demonstrando comportamento linear (ôhmico) entre ±200 mV. A regressão linear fornece valores de resistência da membrana de 847 ± 16 GΩ (n = 6) e 980 ± 32 GΩ (n = 7), respectivamente. (B) Estabilidade da membrana avaliada por meio do monitoramento da resistência durante 1 h em intervalos de 2 min. As membranas permanecem estáveis até ±200 mV e rompem em tensões entre ±220 e ±300 mV. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
Caracterização inicial do comportamento de canais individuais de ancTREK1
O ancTREK1 sintético foi purificado e reconstruído em bicamadas lipídicas planares (PLBs), e a atividade de canais individuais foi monitorada usando protocolos de degrau de tensão que variaram de −120 a 120 mV em incrementos de 20 mV. Os registros de canal único (Figura 9A e Figura 9B) revelaram o comportamento característico de oscilação típico dos canais K2P38. Em 80 mV, a amplitude média da corrente foi de 13,02 ± 0,78 pA (n = 5), enquanto em −80 mV a amplitude da corrente aumentou para −18,72 ± 0,25 pA (n = 5) (Figura 9C). A relação I–V resultante mostrou correntes mensuráveis de canal único em potenciais positivos e negativos sob condições simétricas livres de Mg2+ com 200 mM de potássio (Figura 9D). Como as amplitudes das correntes foram estimadas a partir de histogramas de todos os pontos dos registros adquiridos a 5 kHz e filtrados com passagem baixa em 2,5 kHz, essa relação I–V é apresentada como uma prova descritiva de princípio, e não como uma caracterização biofísica exaustiva.
<img alt="Análise da atividade do canal iônico; gráfico de traços de corrente e histogramas de amplitude em +80 mV, -80 mV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 9"> 
Figura 9: Atividade de canal único da ancTREK1 sintética. (A e B) Traços representativos de corrente de canal único registrados em 80 mV e −80 mV, respectivamente. Linhas tracejadas indicam o nível do canal fechado. (C) Histogramas de amplitude de todos os pontos para potenciais positivos (esquerda) e negativos (direita). (D) Relação I–V da ancTREK1 em condições simétricas de potássio (K+) 200 mM na ausência de cátions bivalentes. A curva foi ajustada utilizando um polinômio de quarta ordem, e os valores de condutância foram derivados da inclinação em ±80 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig9largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.</a>
Embora o ancTREK1 não possua regiões N- e C-terminal alongadas em comparação com os canais TREK1 de mamíferos, ele permaneceu funcionalmente ativo após a reconstrução. Em contraste com o TREK1 de mamíferos, que exibe modos de alta e baixa condutância (132 ± 5 pS e 41 ± 5 pS em potenciais positivos, respectivamente)39, o ancTREK1 exibiu apenas o modo de alta condutância. A condutância unitária em potenciais positivos foi de 112,8 ± 10,8 pS (80 mV, n = 5), consistente com os valores relatados para canais TREK (85–130 pS sob condições simétricas de potássio)38,39,40,41. Em potenciais negativos, a condutância aumentou para 205,6 ± 2,05 pS (−80 mV, n = 5), em concordância com o comportamento previamente descrito para o TREK139. Notavelmente, o ancTREK1 exibiu uma probabilidade de abertura normalizada (NPo) mais alta em comparação com medições de TREK1 obtidas usando configurações de "excised patch"42. A relação NPo–voltagem mostrou aumento da atividade do canal em potenciais positivos, atingindo 0,78 ± 0,02 (n = 5) a 80 mV. Em contraste, o NPo diminuiu em potenciais negativos, com valores de 0,53 ± 0,04 a −80 mV e 0,28 ± 0,03 a −120 mV (Figura 10).
<img alt="Resultados da eletrofisiologia de canais iônicos, gráfico de NPo versus voltagem (mV), comparação em gráfico de barras, análise de dados." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig10.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 10"> 
Figura 10: Análise da dependência em relação à voltagem da atividade de canais únicos de ancTREK1. Probabilidade de abertura normalizada (NPo) em função do potencial da membrana (esquerda) e comparação da NPo em 80 mV e −80 mV (direita), mostrando aumento na abertura do canal em potenciais positivos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
Figura Suplementar 1. Sequência de aminoácidos do canal de potássio sintético ancestral de domínio duplo com dois poros (K2P) (ancTREK1). A sequência completa de aminoácidos do ancTREK1 utilizada para gravações eletrofisiológicas. A sequência foi reconstruída por inferência de sequência ancestral a partir de um conjunto de dados curado de membros da família TREK/TRAAK, incluindo sequências ortólogas coletadas dos bancos de dados UniProt e NCBI, filtradas por motivos conservados do poro, alinhadas e analisadas usando filogenética de máxima verossimilhança.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo descreve o uso de um sistema miniaturizado de bicamada lipídica planar de Montal–Mueller com amplificação integrada para realizar gravações estáveis de canais individuais. O método é demonstrado pela reconstrução de um canal K2P sintético purificado para validar o desempenho do sistema.

Eletrofisiologia de Canal Único Utilizando um Sistema Miniaturizado de Bicamada Lipídica Plana de Montal–Mueller para Gravação de um Canal K2P Sintético

A reconstituição funcional de canais iônicos em bicamadas lipídicas planas fornece uma estratégia para investigar a atividade dos canais ao nível de molécula única. ...

Nossa pesquisa foca em compreender como os canais iônicos e o funcionamento dos transportadores são regulados, utilizando técnicas integradas de biologia estrutural e eletrofisiológicas. Configurações convencionais de bicamadas exigem instrumentação complexa e montagem manual, enquanto esta é uma plataforma miniaturizada, pronta para uso, que integra um amplificador compacto.Para começar, prepare o sistema de eletrofisiologia realizando a calibração do instrumento e preparando os eletrodos de prata ou cloreto de prata. Insira as extremidades não cloradas dos dois fios de prata nos conectores da placa de circuito impresso ou PCB. Coloque as extremidades cloradas dos fios nos canais fluidicos perfurados no componente de polimetilmetacrilato ou PMMA. Gire suavemente o chip de membrana lipídica negra ou BLMchipMM e monte-o sobre o PCB encaixando o dente inferior da câmara de gravação de PMMA na ranhura dedicada. Certifique-se de que o fio alcance o final dos canais fluidicos. Prepare 100 microlitros de uma solução de hexadecano a 1% volume por volume em n-hexano a 100% para o pré-tratamento da abertura do septo. Reconstitua os lipídios 1,2-difitanoil-sn-glicerol-3-fosfocolina ou DPhPC

single-channel-electrophysiology-using-miniaturized-montalmueller

Research

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Eletrofisiologia de Canal Único Utilizando um Sistema Miniaturizado de Bicamada Lipídica Plana de Montal–Mueller para Gravação de um Canal K2P Sintético (Vídeo) | JoVE Journal

Eletrofisiologia de Canal Único Utilizando um Sistema Miniaturizado de Bicamada Lipídica Plana de Montal–Mueller para Gravação de um Canal K_2P Sintético

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