Name: Ensaio da Mamomosfera Revela Estalo Induzido por Api5 em Linhas Celulares Epiteliais da Mama Não Tumorigênicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a realizar ensaio de mamomosfera para avaliar propriedades de células-tronco cancerígenas em células epiteliais da mama não tumorigênicas MCF-10A. Este método permite quantificar formação de esferoides e capacidade de autorrenovação.

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5 minutes

1. Revestimento de placas de cultura de tecidos com poli(2-hidroxietil metacrilato), pHEMA
<ol>
	<li>Dissolva 1,2 g de pHEMA (peso molecular ̴ 300.000) em 100 mL de etanol 95% mexendo constantemente a 65 °C para preparar uma solução de pHEMA a 1,2% (veja a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Recubra as placas padrão de cultura de tecidos com pHEMA aplicando 1 mL por poço de uma placa de 6 poços. O volume da solução de pHEMA pode ser ajustado com base no tamanho do vaso da cultura de tecido.</li>
	<li>Deixe as placas secarem no forno a 40 °C em condições estéreis.</li>
	<li>Expõe as placas à luz UV por 15 minutos, seguida de três lavagens com o soro fosfatado tamponado (DPBS) de Dulbecco, antes de usá-las para preparar o ensaio de formação da mamosfera.</li>
</ol>
2. Semeadura de mamosferas de geração primária
<ol>
	<li>Cultura 3D de células MCF10A dissociadas (controle e superexpressão de Api5) obtida por dissociação de culturas 3D do dia 16 no meio de crescimento14. NOTA: Composição do meio de crescimento: DMEM com alta glicemia, sem piruvato de sódio, suplementado com soro de cavalo a 5%, 10 μg/mL de insulina, 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF), 100 ng/mL de toxina da cólera e 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina (veja Tabela de Materiais).</li>
	<li>Remova o meio gasto, lave as células com 1 mL de DPBS, depois adicione 500 μL de tripsina-EDTA 0,05% e incube a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% deCO2 por 12-15 minutos até que todas as células estejam tripsinizadas.</li>
	<li>Depois que todas as células forem deslocadas, adicione 2 mL de meio de ressassim para neutralizar a atividade da tripsina e gire a suspensão celular a 112 × g por 10 minutos em temperatura ambiente. NOTA: Composição do meio de ressalto: DMEM de alta glicemia, sem piruvato de sódio, suplementado com soro de cavalo a 20% e 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante e ressuspenda a pastilha celular em 1 mL de meio mamosférico. Passe a suspensão da célula por uma agulha de 25 G para obter uma suspensão de célula única. NOTA: Composição do meio da mamosfera: DMEM/F12 suplementado com 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), 1 suplemento × B27 sem vitamina A e 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina (veja Tabela de Materiais).</li>
	<li>Usando um hemocitometro, conte o número de células e calcule o volume de suspensão celular necessário para semear 0,2 × 104 células por poço. NOTA: Mantenha uma baixa densidade de semeadura para determinar com precisão a eficiência da formação da mamosfera, minimizando assim o impacto da agregação celular. Ao coletar lisados proteicos para imunobloting, a densidade celular pode ser aumentada até 2,5 × 10,5 células por poço.</li>
	<li>Dilua o volume necessário de suspensão celular em 2 mL de meio mamomosférico e seme em cada poço de uma placa de 6 poços. As células semente em triplicação para cada condição.</li>
	<li>Incube a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por 7 dias.</li>
	<li>Após sete dias em cultura, conte manualmente o número de mamosferas com diâmetro superior a 50 μm em cada poço, seja usando um microscópio equipado com graticule ou uma grade de quadrantes sob um microscópio óptico.</li>
	<li>Fotografe as mamosferas usando uma câmera digital instalada em um microscópio óptico com ampliação de 20x.</li>
	<li>Calcule a eficiência de formação da mamosfera (MFE) usando a seguinte fórmula5 
	 <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
3. Semeadura de mamosferas de geração secundária
<ol>
	<li>Colete as mamosferas formadas na primeira geração em um tubo de 15 mL e centrifuge a 300 × g por 10 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante, deixando o pellet de mamosera para trás.</li>
	<li>Lave o pellet com DPBS.</li>
	<li>Adicione 200 μL de 0,05% de tripsina-EDTA ao pellet da mamosfera e incube a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5%CO2 por 2-3 minutos. Passe as mamosferas na solução de tripsina por uma agulha de 25 G três vezes para obter uma suspensão de célula única.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de meio de ressuspensão para neutralizar a atividade da tripsina e gire a suspensão celular a 112 × g por 10 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em 0,5 mL de meio mamosférico.</li>
	<li>Usando um hemocitometro, conte o número de células e calcule o volume de suspensão celular necessário para semear 0,2 × 104 células por poço. NOTA: Mantenha uma baixa densidade celular para avaliar a capacidade de autorrenovação, minimizando assim o efeito da agregação celular.</li>
	<li>Dilua o volume necessário de suspensão celular em 2 mL de meio mamomosférico e seme em cada poço de uma placa de 6 poços. As células semente em triplicação para cada condição.</li>
	<li>Incube a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por 7 dias.</li>
	<li>Após 7 dias em cultura, conte o número de mamosferas com diâmetro maior que 50 μm em cada placa usando um microscópio equipado com graticula ou uma grade de quadrante.</li>
	<li>Fotografe as mamosferas usando uma câmera digital instalada em um microscópio óptico com ampliação de 20x.</li>
	<li>Calcule a capacidade de autorrenovação usando a seguinte fórmula5 
	<img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq2v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. Western blot para detectar as mudanças nos marcadores de pluripotência após a superexpressão de Api5
<ol>
	<li>Colete as mamosferas formadas na primeira geração em um tubo de 15 mL e centrifuge a 300 × g por 10 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante, deixando o pellet de mamosera para trás.</li>
	<li>Lave o pellet com DPBS.</li>
	<li>Colete o pellet em um tampão RIPA gelado para obter o lisato proteico e realize a imunoblotting de acordo com o protocolopadrão 24. NOTA: Composição do tampão RIPA: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% dodecilsulfato de sódio (SDS), 1 mM de ácido etilenediaminotetraacético (EDTA), 1 mM de fenilmetilsulfonilo fluoreto (PMSF), 10 mM de fluoreto de sódio, 1 mM ortovanato de sódio.</li>
	<li>Sonde marcadores de caule - Oct3/4, Nanog, Sox2 e Bmi1, e controle de carga GAPDH (veja Tabela de Materiais para diluições de anticorpos).</li>
	<li>Quantifique os níveis de proteínas usando análise densitométrica no ImageJ. Selecione a região de interesse nas imagens de Western blot e gere um perfil de densidade para cada faixa.</li>
	<li>Normalize as densidades relativas da proteína de interesse em relação às do GAPDH para cada faixa. Calcule a mudança de dobra para cada proteína.</li>
	<li>Plote a mudança de dobras nos níveis de proteína usando qualquer software de plotagem.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Kim, R. J., Nam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCT4+expression+enhances+features+of+cancer+stem+cells+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer.</a> Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotency+factor+nanog+promotes+breast+cancer+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis.</a> Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Paranjape, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+self-renewal+and+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+breast+cancer+cells+through+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog.</a> BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).</li>
<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
<li>Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+anti-apoptotic+protein+Api5+affects+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis.</a> BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
<li>Jang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+induces+cisplatin+resistance+through+FGFR+signaling+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells.</a> Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Eyre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+mammosphere+and+xenograft+tumour+initiation+correlates+with+progression+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C humidified incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 Rabbit pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Rabbit mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4 Antibody (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;1 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>100 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>Ethanol absolute 99.9%</td><td>Jebsen &amp; Jessen GmbH &amp; Co. Germany</td><td>58051 L05</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr><tr><td>Hydrocortisone&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>1 mg/mL stock in ethanol</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 microscope</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td></td><td></td><td>Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plotting software&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>1.2% pHEMA in 95% ethanol</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio da mamomosfera revela estalo induzido por api5 em linhas celulares epiteliais da mama não tumorigênicas

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

Para avaliar a eficiência da formação da mamomosfera sob condições não aderentes, células MCF10A dissociadas de controle e sobreexpressão de Api5 foram semeadas em placas revestidas com poliHEMA conforme o protocolo. Células Api5 superexpressas demonstraram um aumento de 1,58 vezes na eficiência média de formação da mamosfera do que os controles (Figuras 1B,C). Esse aumento demonstra que uma maior expressão de Api5 incrementa a proporção de progenitores semelhantes a células...

Ensaio da Mamomosfera Revela Estalo Induzido por Api5 em Linhas Celulares Epiteliais da Mama Não Tumorigênicas

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

mammosphere-assay-reveals-api5-induced-stemness-non-tumorigenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve o isolamento de células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de câncer de mama. Cultivamos essas células-tronco cancerígenas para gerar mamosferas primárias para avaliar a auto-renovação e calcular a eficiência de formação de esferas, permitindo a comparação entre diferentes densidades de semeadura.

Geração de Mamosferas Primárias: Uma Técnica para Determinar a Potência Celular

Um método para processar o material de descarte mamária humana cirúrgico é descrito. Tecido transformado, sob a forma de Organóides, podem ser armazenadas congeladas indefinidamente ou colocadas em cultura para crescimento a longo prazo. Este método permite a análise experimental da biologia celular epitelial humana normal, e os efeitos das perturbações exógenas.

Processamento da mamoplastia redutora e tecidos humanos Mastectomia para cultura de células

Lapso de tempo de imagem é utilizado para avaliar o comportamento dos principais pré-neoplásicas células epiteliais mamárias derivados de modelos de ratos geneticamente modificados de risco de câncer de mama para determinar se há correlação entre os parâmetros específicos de comportamento e distintas lesões genéticas.

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Cultura primária de células de tecidos intactos utilizando Organóides proporciona um sistema modelo que imita o microambiente de multi-celular, in vivo. Foi desenvolvido um modelo de cultura livre de soro primário tecido epitelial da mama que perpetua linhagens de cultura de células mistas e exposições diferenciadas morfologia, sem rompimento do tecido enzimática. Organóides mama permanecer viáveis ​​por&gt; 6 meses.

Não enzimática, Soro livre de Cultura de Tecidos de lesões mamárias pré-invasivas para a geração espontânea de Mammospheres

Os ensaios de esferas in vitro são comumente usados para identificar células-tronco cancerígenas. Aqui, comparamos ensaios de esferas únicas com multicélulas. Os ensaios baseados em células únicas mais trabalhosos ou a suplementação de metilcelulose fornecem resultados mais precisos, enquanto os ensaios baseados em várias células realizados em meio líquido podem ser altamente influenciados pela densidade celular.

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

Os ensaios de mamosfera flutuante podem investigar o subconjunto de células-tronco de câncer de mama que sobrevivem em condições de suspensão e mostram tumorigênese aumentada quando implantadas em camundongos.  Este protocolo fornece uma medida in vitro conveniente da capacidade de formação de esferas, um proxy para a tumorigênese in vivo, ao mesmo tempo em que facilita a análise da paisagem transcricional associada ao tronco.

Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

O objetivo dessa metodologia é identificar células-tronco cancerígenas (CSC) em linhas de células cancerosas e amostras primárias de tumor humano com o protocolo de formação da esfera, de forma robusta, utilizando ensaios funcionais e caracterização phenotípica com citometria de fluxo e ocidental Borrão.

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

Aqui, descrevemos a implementação e interpretação dos resultados de um ensaio quantitativo de auto-renovação in vitro mammosphere.

Quantificação da auto-renovação em Culturas Murine Mammosphere

Este protocolo fornece ferramentas in vitro experimentais para avaliar a transformação das células mamárias humanas. São descritas etapas detalhadas para a taxa de proliferação celular de acompanhamento, capacidade de crescimento independente de ancoragem e distribuição de linhagens celulares em culturas 3D com matriz de membrana de porão.

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Este protocolo experimental descreve o isolamento de CBSCs de amostras de células e tecidos de câncer de mama, bem como os ensaios in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o fenótipo e a função do CBSC.

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Este protocolo descreve uma abordagem escalável de triagem intraductal CRISPR, permitindo estudos paralelos in vivo de eliminação e ativação genética na glândula mamária do camundongo.

Triagem In Vivo Paralela da Eliminação e Ativação Gênica na Glândula Mamária do Camundongo

Aprenda a realizar ensaio de mamomosfera para avaliar propriedades de células-tronco cancerígenas em células epiteliais da mama não tumorigênicas MCF-10A. Este método permite quantificar formação de esferoides e capacidade de autorrenovação.

Ensaio da Mamomosfera Revela Estalo Induzido por Api5 em Linhas Celulares Epiteliais da Mama Não Tumorigênicas

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