Sequenciamento Metagenômico de Próxima Geração do Líquido Cefalorraquidiano para a Detecção de Patógenos do Sistema Nervoso Central

Este é um protocolo baseado em pesquisa para sequenciamento Metagenômico de próxima geração de amostras de líquido cefalorraquidiano para permitir a detecção de patógenos potenciais dentro da amostra. Os protocolos MNGS existentes não levam em conta o baixo rendimento de RNA dentro do LCR. Esse protocolo otimiza várias etapas para levar em conta a baixa biomassa presente nessas amostras.

Para começar a descongelar as amostras de LCR no gelo, transfira 100 microlitros para um mililitro de cada amostra para um tubo de 1,5 mililitro e centrifuge a 16.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois, pipetee cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás a bola e 100 microlitros de sobrenadante. Adicione 100 microlitros de escudo de RNA de DNA aos restantes 100 microlitros do sobrenadante e do pellet e misture completamente.

Depois, adicione 600 microlitros de tampão de lise de RNA de DNA e misture pipetando até que a solução fique homogênea. Realize o protocolo de extração de DNA e RNA conforme as instruções do fabricante, com as seguintes modificações importantes. Realize todas as etapas da centrifugação por um minuto na velocidade máxima, exceto a lavagem final de RNA de DNA, que deve ser centrifugada por três minutos.

Para eluir a amostra, adicione 22 microlitros de água livre de nuclease diretamente sobre a matriz da coluna. Depois, incube por três minutos em temperatura ambiente. Após a pipeta eluciana, o fluxo retorna à matriz da coluna, centrifuge novamente por um minuto na velocidade máxima antes de transferir a amostra para um novo tubo de armazenamento de 1,5 mililitro.

Pipete os componentes necessários para fragmentação e preparação de RNA em um tubo de PCR. Incube o tubo em um termociclador com a tampa aquecida ajustada para 105 graus Celsius. Pipetas misturam o RNA fragmentado e preparado com oito microlitros de água livre de nuclease e dois microlitros de mistura enzimática de síntese de primeira fita.

Incube o tubo em um termociclador com a tampa aquecida ajustada para 105 graus Celsius. Depois, misture o DNA sintetizado pela primeira fita com 48 microlitros de água sem nuclease. Oito microlitros de buffer de reação de síntese de segunda cadeia e quatro microlitros de mistura enzimática de síntese de segunda fita.

Coloque o tubo em um termociclador e incube por uma hora a 16 graus Celsius com a tampa aquecida desligada. Em seguida, realize a purificação de esferas magnéticas usando uma proporção de 1,8 vezes de esferas magnéticas de imobilização reversível em fase sólida. Elude a amostra em 53 microlitros de água livre de nuclease.

Transfira 50 microlitros do CDNA purificado purificado de cadeia dupla contendo supernadante final para um tubo de PCR limpo e livre de nuclease. Neste ponto, as amostras podem ser congeladas a menos 20 graus Celsius durante a noite. Se a amostra foi armazenada a menos 20 graus Celsius durante a noite, descongele no gelo antes de reiniciar.

Mistura pipetas 50 microlitros de CDNA purificado de fita dupla com sete microlitros de buffer de reação de preparação final e três microlitros de mistura enzimática de preparação final. Coloque as amostras em um termociclador e incube a 20 graus Celsius por 30 minutos e 65 graus Celsius por 30 minutos com a tampa aquecida desligada. Em seguida, realize a etapa de ligação do adaptador no gelo criando primeiro uma diluição de um a 100 do adaptador em água livre de nuclease.

Pipete, a mistura da reação de preparação final em um tubo contendo 30 microlitros de mistura mestre de ligação, um micrôlitro de potenciador de ligação e 2,5 microlitros do adaptador diluído. Coloque as amostras em um termociclador e incube a 20 graus Celsius por 15 minutos com a tampa aquecida desligada. Depois disso, proceda imediatamente à purificação de esferas magnéticas usando uma razão 0,9 vezes de esferas magnéticas de imobilização reversível em fase sólida.

Depois, elua em 17 microlitros de água livre de nuclease. Transfira 15 microlitros do supernadante final para um tubo PCR limpo e livre de nuclease. Agora o adaptador purificado por pipeta ligava CDNA em um tubo com três microlitros de enzima do usuário, 25 microlitros de mistura master Q 5 e 10 microlitros de primers únicos com código de barras.

Coloque o tubo em um termociclador com a tampa aquecida ajustada a 105 graus Celsius e incube nas condições apresentadas. Realize uma purificação final das esferas magnéticas usando uma proporção de 0,8 vezes as esferas magnéticas. Depois, elude a amostra em 23 microlitros de água livre de nuclease.

Transfira 20 microlitros do supernadante final para um tubo PCR limpo e livre de nuclease. Quantifique a concentração das bibliotecas de amostras usando um kit de quantificação de DNA e o flúor correspondente. Verifique se os controles de água têm concentrações substancialmente menores ou não quantificáveis em comparação com as outras amostras.

Avalie o tamanho da biblioteca de amostras rodando as amostras em uma máquina automatizada de eletroforese capilar. Use a plataforma web de código aberto, Chan Zuckerberg ID, para realizar análises metagenômicas para detecção de patógenos. Faça login no ID de Chan Zuckerberg e clique em enviar.

Selecione metagenômica como tipo de análise e escolha os arquivos FASTQ de entrada da execução de sequenciamento. Insira as informações necessárias da amostra, incluindo nome da amostra, tipo de amostra, LCR e tipo nucleotídico RNA ou DNA. Quando o processamento estiver concluído, clique na pasta do projeto contendo os exemplos e navegue até o painel de resumo.

Role para baixo para examinar o número de leituras por amostra. Revise a porcentagem de leituras passando pelo controle de qualidade e pela taxa de compressão duplicada para avaliar PCR enviesada sobre amplificação. Para determinar qualquer contaminação por DNA estranho dentro da pasta do projeto, selecione cada amostra de controle de água e clique em modelo de fundo para gerar o modelo.

Durante a análise, aplique o modelo e utilize filtros de limiar para definir uma pontuação NTZ maior que um para remover prováveis contaminantes. Depois, analise os dados usando um software estatístico apropriado. Os dados da eletroforese capilar e eletroferograma demonstraram uma biblioteca de amostras de CDNA que estava sobrefragmentada e continha dímeros adaptadores não para sequenciamento.

A biblioteca CDNA, sem contaminação significativa por dímeros adaptadores, estava pronta para agrupamento e sequenciamento. O sequenciamento de próxima geração metagenômico do LCR detectou patógenos diversos nas coortes A e B, com pelo menos um patógeno em 73,5% das amostras da coorte A e 51,2% das amostras da coorte B. Um desafio fundamental é a pipetagem precisa devido aos baixos volumes, juntamente com a secagem sensível ao tempo, onde secagem insuficiente ou excessiva pode comprometer os resultados.

Embora esse protocolo específico seja focado no lado da detecção de patógenos, os transcritos de RNA hospedeiro gerados por esse protocolo podem ser usados para análises adicionais a jusante. Por isso, é importante para estudos futuros comparar o desempenho desse protocolo específico de preparação e sequenciamento de bibliotecas com métodos emergentes projetados também para amostras escassas, para ver como ele se encaixa, não apenas em termos de detecção de patógenos, mas também para análises transcriptômicas.