Extração de Ácidos Graxos de Cadeia Curta de Fezes de Camundongos Usando um Método Ácido-Solvente de Duas Fases

Esse protocolo permite a extração de ácidos graxos de cadeia curta ou SCFAs de amostras fecais de camundongos de baixa entrada para análise rotineira baseada em cromatografia gasosa. As SCFAs, incluindo acetato, propionato e butirato, são produzidas pela microbiota intestinal por meio da fermentação da fibra alimentar. Eles são amplamente estudados porque estão associados a fenótipos comportamentais, metabólicos e fisiológicos.

No entanto, quantificar as SCFAs em amostras fecais continua sendo desafiador. Esses metabólitos são voláteis, frequentemente presentes em níveis baixos, e são medidos em matrizes biológicas complexas. Em estudos com camundongos, a quantidade de material fecal coletada de cada animal também é frequentemente limitada.

Métodos padrão podem exigir derivatização, volumes de amostras relativamente grandes ou equipamentos especializados. Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho de extração com solvente ácido em duas fases usando ácido clorídrico diluído e acetato de etila para a extração de SCFAs de amostras fecais de camundongos de baixa entrada, em um formato compatível com análise rotineira de GC. Então começamos com nosso layout correto para continuar com o restante do protocolo.

Em seguida, temos nossa caixa de amostras com as amostras de fezes congeladas corretamente rotuladas. Em seguida, ajustamos nossa pipeta de 1000 microlitros para 255. Agora temos nossa diluição de HCl rotulada.

Continuamos alocando HCl em cada uma de nossas amostras. Agora, colocamos etanol no poço de limpeza para a pinça. Agora, usamos o mesmo etanol para criar nosso banho para os pilões.

Agora, pegamos nossas amostras fecais e as colocamos nos frascos da centrífuga. Agora, usamos nossos pilões limpos para moer cada amostra de fezes dentro de seus respectivos frascos de centrífuga. Coletamos nossas amostras e as aplicamos no vórtice por pelo menos 10 segundos ou até que estejam completamente misturadas.

Levamos as amostras mistas para nossa centrífuga e montamos. Garanta o equilíbrio adequado da centrífuga. Ajuste a centrífuga para 16.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Após 10 minutos, retire suas amostras da centrífuga. Renomee novos frascos de centrífuga correspondentes às suas amostras. Ajuste sua pipeta de 200 microlitros para 120.

Remova cuidadosamente o sobrenadante, certificando-se de não tocar na bola. Transfira o sobrenadante para seus novos frascos respectivos. Você pode descartar a cápsula.

Adicione uma quantidade igual de acetato de etílio nos seus novos frascos. Traga essas amostras de volta para a centrífuga. Ajuste a centrífuga para 2.374 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Depois de 20 minutos, retire suas amostras. Renomee novos frascos de centrífuga correspondentes às suas amostras. Ajuste sua pipeta para 120 microlitros.

Cuidado para não tocar na camada inferior, removendo apenas a camada superior. Transfira o sobrenadante para novos frascos corretamente rotulados. Transfira essas amostras para sua caixa de amostras para armazenamento até análise posterior.

Por fim, coloque uma caixa de amostra em um freezer com menos 80 graus Celsius. As alíquotas extraídas do SCFA, 120 microlitros cada, foram armazenadas a -80 graus Celsius antes da quantificação usando cromatografia gasosa. A análise quantitativa identificou oito SCFAs, incluindo os principais metabólitos: ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico, conforme mostrado na figura.

Para validar o isolamento do SCFA, os dados de cromatografia gasosa foram avaliados por meio de testes de recuperação e reprodutibilidade. A recuperação foi avaliada por amostras controle com aumento das concentrações conhecidas do padrão interno, enquanto a reprodutibilidade foi verificada por análises repetidas dentro e ao longo de dias. Em resumo, esse protocolo fornece um fluxo de trabalho para extração de SCFA a partir de amostras de fezes de camundongos de baixa entrada.

Não requer derivatização e é compatível com análises rotineiras baseadas em GC. Esse método pode suportar a medição de SCFA fecal em diversos modelos de camundongos.