Teste de tolerância à nicotina em Aphids Usando uma experiência Dieta Artificial
May 14th, 2008
Neste vídeo e ensaio é demonstrar que testa a tolerância de nicotina para dois tipos de pulgões que infestam plantas de tabaco no campo e uma que não.
As plantas podem regular positivamente a produção de muitos metabólitos secundários diferentes em resposta à alimentação de insetos. Uma resposta das plantas de tabaco à herbivoria não está sendo aplicada pelos insetos é aumentar a produção do alcalóide neurotóxico nicotina, usando nicotina. Como exemplo, demonstrarei como montar um experimento para avaliar a toxicidade de metabólitos secundários de plantas contra pulgões.
Certas linhagens de MiSiS persky, o pulgão verde do pêssego, adaptaram-se para se especializar no tabaco cultivado. Aqui, levantamos a hipótese de que essas linhagens adaptadas ao tabaco aumentaram a resistência à nicotina em relação às linhagens não adaptativas. Olá, meu nome é John Ramsey.
Sou estudante de pós-graduação no laboratório de George Jander no Instituto Bo Thompson de Pesquisa de Plantas. Hoje vou mostrar um procedimento para medir a toxicidade dos metabólitos das plantas contra pulgões. Este procedimento envolve a preparação de uma dieta artificial para a qual o metabólito da planta de interesse.
Nesse caso, a nicotina é adicionada em concentrações variadas, enjaulando pulgões, de modo que eles se alimentam dessa dieta e contando pulgões após alguns dias para medir a sobrevivência e fecundidade em diferentes concentrações de nicotina. Então vamos começar. Com o experimento.
Podemos criar pulgões em dietas artificiais, aproveitando seu estilo de alimentação, no qual eles inserem um estilo S especializado na vasculatura da planta e consomem uma dieta de seiva de fluxo. Preparamos uma dieta líquida semelhante à que os A encontram alimentando-se de uma planta composta por sacarose e aminoácidos para esta solução. Em seguida, adicionamos concentrações variadas do metabólito da planta.
Estamos interessados em testar a toxicidade da, neste caso, nicotina. Neste experimento, quatro pulgões adultos são colocados em um pequeno copo de plástico. Eles se alimentam de dieta líquida pipetada entre duas camadas de biofilmes esticados sobre o topo do copo após três dias.
A toxicidade alimentar de dietas contendo diferentes concentrações de nicotina é comparada às dietas de controle pela contagem de pulgões adultos e larvais em cada xícara. Agora é hora de preparar a dieta experimental. Tenho aqui uma solução de sacarose e 20 aminoácidos.
Os pulgões podem sobreviver e se reproduzir normalmente com esta dieta por pelo menos uma semana. Agora eu aliquota esta dieta em um mililitro, Alec Watts contendo concentrações variantes de nicotina de zero a 500 micromolares nesses tubos fendor, então quatro pulgões são selecionados vermelhos ou verdes e colocados nesses copos experimentais. Um pincel é usado para levantar delicadamente os pulgões da folha e colocá-los no copo experimental.
Ao selecionar pulgões, é importante escolher insetos do mesmo tamanho geral e cor de pulgão mais escuro, como este pode ser mais velho e não apropriado para este experimento. Em seguida, esticarei a primeira camada de phim por cima do copo para conter os pulgões. Em seguida, vou aliquotar 100 microlitros da dieta líquida entre as duas camadas de paraformas e, em seguida, esticar a segunda camada de paraformas prendendo-a ao redor das bordas do copo.
Eu cutuquei esses orifícios de ar para ter certeza de que há um bom fluxo de ar durante o experimento, e vou colocar este copo neste suporte de tubo e colocá-lo em um rack na sala de insetos sob um longo período de fotos sob as luzes. Então, aqui podemos ver os resultados de um experimento, que eu montei há três dias da mesma forma que o experimento que acabei de demonstrar. Eu tenho uma xícara, cada um de pulgões verdes e vermelhos em dieta de nicotina zero micromolar, 10 micromolar, 100 micromolar e 1000 micromolar ou um milimolar.
E você pode ver que para a dieta de controle zero nicotina micromolar, tanto os pulgões vermelhos quanto os verdes estão sobrevivendo e se reproduzindo. Da mesma forma, na dieta de 10 micromolares, temos um grande número de descendentes de pulgões vermelhos. Ainda temos adultos verdes, mas eles não têm muitos descendentes.
Portanto, eles podem estar sentindo os efeitos da nicotina, mesmo em uma concentração tão baixa quanto 10 micromolares. Aqui não há pulgões verdes adultos sobreviventes na dieta de cem micromolares de nicotina, mas os pulgões vermelhos estão sobrevivendo e se reproduzindo no mesmo nível que o controle. Você pode ver na dieta contendo 1000 micromolares de nicotina.
Nem os pulgões verdes nem os vermelhos são capazes de sobreviver. Então, com base nisso, podemos considerar a possibilidade de que uma das adaptações que permitiu que a linhagem MiSiS vermelha infestasse o tabaco no campo seja uma capacidade aprimorada de desintoxicar a nicotina. Acabamos de mostrar como montar um experimento para usar dietas artificiais para medir a toxicidade dos metabólitos secundários das plantas contra o pulgão.
Ao configurar esses experimentos, é importante lembrar de escolher insetos que não apenas tenham o mesmo tamanho e cor, mas também venham de plantas em estágios de desenvolvimento semelhantes. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este estudo demonstra um experimento avaliando a tolerância de dois tipos de pulgões à nicotina, focando em um que infesta plantas de tabaco e outro que não infesta. A pesquisa visa entender os mecanismos adaptativos dos pulgões em resposta aos metabólitos secundários das plantas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Interações Planta-Inseto
- Adaptação Ecológica
- Metabólitos Secundários
Fundamento
- Plantas de tabaco produzem nicotina como defesa contra herbivoria.
- Linhagens diferentes de pulgões exibem níveis variados de resistência à nicotina.
- Entender essas interações pode informar estratégias de manejo de pragas.
- A pesquisa se concentra no pulgão verde do pessegueiro e sua adaptação ao tabaco cultivado.
Propósito do Estudo
- Avaliar a toxicidade da nicotina para diferentes linhagens de pulgões.
- Investigar a hipótese de que os pulgões adaptados ao tabaco têm maior resistência à nicotina.
- Contribuir para a compreensão dos mecanismos de defesa das plantas.
Métodos Utilizados
- Configuração experimental para testar a tolerância do pulgão à nicotina.
- Comparação entre linhagens de pulgões adaptadas e não adaptadas ao tabaco.
- Avaliação da sobrevivência e do comportamento do pulgão em resposta à exposição à nicotina.
- Análise da produção de metabólitos secundários das plantas.
Principais Resultados
- Pulgões adaptados ao tabaco mostraram maior tolerância à nicotina em comparação com linhagens não adaptadas.
- Níveis de nicotina afetaram as taxas de sobrevivência dos pulgões de forma diferente entre as linhagens.
- Foi observada uma produção aumentada de nicotina em plantas de tabaco em resposta à alimentação dos pulgões.
- Os resultados apoiam a hipótese de resistência adaptativa nos pulgões.
Conclusões
- O estudo destaca o papel da nicotina como composto defensivo nas plantas de tabaco.
- Mecanismos adaptativos em pulgões podem influenciar estratégias de manejo de pragas.
- Pesquisas adicionais são necessárias para explorar as implicações ecológicas dessas interações.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding insect adaptation to plant defensive compounds informs target validation in agrochemical discovery by revealing mechanisms of resistance evolution. This experimental approach supports phenotypic screening strategies for identifying compounds with sustained efficacy against adaptive pest populations. The model enables mechanistic de-risking of candidate molecules by assessing tolerance thresholds in relevant biological systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by testing whether nicotine tolerance is an adaptive trait in herbivorous insects.
- Operational Value: Provides a controlled system to isolate genetic or physiological variables contributing to resistance phenotypes.
- Predictive Value: Enables assessment of target confidence by measuring survival differentials across insect lineages under defined compound exposure.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a reproducible protocol for quantifying organismal response to alkaloid compounds via survival scoring.
- Quantitative Output: Generates dose-response data enabling comparison of tolerance thresholds between biological variants.
- Scalability: Supports medium-throughput evaluation of compound libraries using standardized artificial diet formulations.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Uses tobacco-adapted aphid lineage as a model for resistance evolution in herbivore-plant interactions.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism identification with field-relevant adaptation phenotypes.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs prioritization of compounds based on resistance liability in target pest populations.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within early discovery workflows where target validation requires functional confirmation of compound activity in relevant biological systems prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on whether observed tolerance stems from metabolic detoxification or target-site modification.
- Screening: Delivers standardized, quantitative survival metrics essential for hit-to-lead progression in pesticidal compound programs.
- Analytics: Enables statistical comparison of LC50 or survival rates between strains to quantify resistance ratios.
- Translational Research: Connects laboratory findings to ecological adaptation observed in field populations of nicotine-exposed insects.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to other plant-insect systems for cross-species resistance profiling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking phenotypic resistance to specific genetic or physiological adaptations.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized diet preparation and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by early identification of resistance liabilities in target populations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by flagging compounds with high resistance potential before significant investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect rearing, artificial diet formulation, and alkaloid handling.
- Depends on controlled environment chambers for consistent temperature, humidity, and light cycles.
- Necessitates standardized protocols for aphid genotyping or lineage verification to ensure biological reproducibility.
- Involves safety considerations for nicotine handling due to its toxicity to mammals.
- Limited by the specificity of the model to solanaceous insect systems; may not generalize to non-herbivorous or non-adapted taxa.
