Imagem de Superresolução e Gerenciamento Compartilhado: Um Protocolo para Microscopia Confocal com Detecção de Multiplex

Nossa pesquisa foca no desenvolvimento de métodos acessíveis de imagem de super-resolução para visualizar estruturas subcelulares dinâmicas, superando o limite de difração da microscopia convencional. O método de super-resolução enfrenta fototoxicidade, operação complexa e preparação especializada. Esse protocolo reduz essas barreiras por meio da detecção de multiplex baseada em confocal.

Para começar, ligue a unidade principal do microscópio, o módulo de lançamento a laser, a fonte de luz LED e o computador de controle. Inicie o software operacional do microscópio. Na interface principal, selecione GFP e depois escolha desligar a luz refletida.

Navegue até o painel de Aquisições. No menu suspenso de lentes objetivas, selecione a lente objetiva apropriada. Para imagens de células vivas, de 45 a 60 minutos antes da imagem, ative a câmara ambiental e o sistema ativo de estabilização de foco.

Após a estabilização do sistema, verifique a estabilidade usando os sensores da câmara. Aplique óleo de imersão na lente frontal do objetivo sem introduzir bolhas. Coloque a amostra preparada no palco do microscópio.

Levante-o cuidadosamente até que o engobe de cobertura toque o óleo de imersão. Em seguida, abra o software de aquisição. Vá até a aba Aquisição e selecione criar um novo experimento.

Agora, adicione trilhas de imagem para os fluoróforos usados. Para cada trilho, ajuste o diâmetro do orifício confocal para uma unidade de ar. Para otimizar a potência do laser, selecione o primeiro canal e mude para o modo de varredura ao vivo.

Ajuste a potência inicial do laser para um valor baixo, depois ajuste o ganho do detector para um nível moderado dentro de sua faixa linear. Depois disso, aumente gradualmente a potência do laser até que as estruturas alvo fiquem claramente visíveis acima do fundo na imagem ao vivo. Defina o tamanho do pixel usando o botão de amostragem Nyquist do software para calculá-lo automaticamente.

Em seguida, defina o tempo dos pixels. Agora, selecione o modo de varredura sequencial entre as trilhas para minimizar a diafonia. Clique em Snap para adquirir uma única imagem.

Salve a imagem com os metadados relevantes. Para configurações consistentes entre seções ópticas, confirme que todos os parâmetros de imagem estão configurados em um único plano focal ótimo antes de definir a pilha Z. Abra a aba Aquisição e selecione o modo Z-stack.

Defina o volume de interesse usando uma varredura ao vivo em alta velocidade para focar primeiro na estrutura mais baixa de interesse, depois clique em Definir Último ou Final. Ajuste cuidadosamente o foco para cima até a estrutura mais alta de interesse e clique em Definir Primeiro ou Cima. O software então exibe a profundidade total.

O tamanho da pilha Z é definido para atender ao critério de amostragem de Nyquist. Use o botão Ótimo para calcular automaticamente. Após configurar os parâmetros de imagem para cada canal, aumente levemente a potência ou ganho do laser para sinais fracos em comparação com uma única imagem bidimensional.

Comece a aquisição para coletar toda a pilha de imagens. Para visualização, use o módulo nativo de processamento do microscópio. Gerar projeções de intensidade máxima para visualizar todos os sinais em foco em uma única imagem bidimensional.

Depois, realize renderização de volume usando os algoritmos integrados ao software para gerar uma representação tridimensional. Ajuste o brilho, a opacidade e a iluminação conforme necessário. Subsequentemente, gerar seções ortogonais XZ e YZ para inspecionar a extensão e o registro do eixo.

Imagens de fluorescência multicoloridas em células fixas de COS-7 mostraram que os núcleos, mitocôndrias e microtúbulos estavam claramente marcados com sobreposição mínima, confirmando varredura sequencial eficaz e detecção otimizada. A projeção de máxima intensidade integra sinais em todas as seções ópticas, destacando a distribuição espacial das estruturas marcadas fluorescente. Uma reconstrução tridimensional fornece uma visão consciente da profundidade da arquitetura do exemplo.

Imagens em time-lapse de células vivas Hep 3B com mitocôndrias marcadas com EGFP são comparadas entre os vários modos. Quadros confocais em pontos de tempo mostram estruturas claras, mas perda gradual de sinal. Quadros padrão de super resolução ou SR mostram resolução maior, mas aumento do clareamento fotográfico ao longo do tempo.

Imagens de super resolução rápida ou SR-4Y mantêm fluorescência estável mesmo em momentos posteriores. O gráfico da intensidade média de fluorescência do EGFP em 100 pontos de tempo demonstra que o modo SR-4Y manteve o sinal mais estável. O desempenho de imagem em células fixas COS-7 foi comparado entre os modos, e modos de super-resolução forneceram detalhes estruturais mais claros do que os confocais.

A medição da função de espalhamento pontual usando esferas fluorescentes de 100 nanômetros mostrou que a SR de Airyscan com desconvolução articular subsequente melhorou a resolução lateral e axial em comparação apenas com a SR de Airyscan isoladamente. Esse protocolo permite que pesquisadores estudem a morfologia dos organelos, dinâmica do citoesqueleto e colocalização de moléculas tanto em células fixas quanto vivas com resolução de aproximadamente 120 nanômetros. A consideração mais crítica desse protocolo é a preparação meticulosa da amostra usando vidro de cobertura de alta qualidade e coloração otimizada para garantir a integridade do sinal para processamento em super-resolução.

Seguindo esse procedimento, os pesquisadores podem realizar análises quantitativas de imagens, como medir a relação sinal-ruído ou colocalização, usando softwares dedicados como o ImageJ.