Name: Imagem de Superresolução e Gerenciamento Compartilhado: Um Protocolo para Microscopia Confocal com Detecção de Multiplex (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda microscopia confocal com detecção multiplexada para imagem de superresolução em células vivas e fixas. Este protocolo permite visualizar estruturas subcelulares dinâmicas com resolução de aproximadamente 120 nanômetros.

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<ol><li>Prakash, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+in+super-resolution+microscopy+-+definition%2C+trade-offs+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Resolution in super-resolution microscopy - definition, trade-offs and perspectives.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 677-682 (2024).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nat Cell Biol. 21, 72-84 (2019).</li>
<li>Bond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+advances+in+super-resolution+microscopy+to+study+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes.</a> Mol Cell. 82, 315-332 (2022).</li>
<li>Huff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+2D+super-resolution+mode+for+ZEISS+Airyscan%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The new 2D super-resolution mode for ZEISS Airyscan.</a> Nat Methods. 14, 1223(2017).</li>
<li>Wu, X., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZEISS+Airyscan%3A+Optimizing+Usage+for+Fast+Gentle%2C+Super-Resolution+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ZEISS Airyscan: Optimizing Usage for Fast Gentle, Super-Resolution Imaging.</a> Methods Mol Biol. 2304, 111-130 (2021).</li>
<li>Yin, W., Liu, S. S., Zhao, Q. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+strategy+for+fast+super-resolution+imaging+parameters+based+on+LSM+900%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization strategy for fast super-resolution imaging parameters based on LSM 900.</a> Chin J Cell Biol. 47, 1644-1655 (2025).</li>
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<li>Ranjan, R., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+live+cell+imaging+of+subcellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution live cell imaging of subcellular structures.</a> J Vis Exp. (167), e61563(2021).</li>
<li>Harmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airyscan+super+resolution+microscopy+to+study+trypanosomatid+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Airyscan super resolution microscopy to study trypanosomatid cell biology.</a> Methods Mol Biol. 2116, 449-461 (2020).</li>
<li>Lin, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+functions+and+management+of+laser+scanning+confocal+microscopy+LSM880+with+Airyscan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chin+Electron+Microsc+Soc%22%5BJournal%5D)">Advanced functions and management of laser scanning confocal microscopy LSM880 with Airyscan.</a> J Chin Electron Microsc Soc. 38, 271-275 (2019).</li>
<li>Li, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+imaging+characteristics+and+applications+of+LSCM880+with+Airyscan+and+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Innov+Appl%22%5BJournal%5D)">Comparative study on imaging characteristics and applications of LSCM880 with Airyscan and spinning disk confocal microscopy.</a> Technol Innov Appl. 32, 4-8 (2020).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. 16, 1159-1163 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+Vasohibin+1+speeds+contraction+and+relaxation+in+failing+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of Vasohibin 1 speeds contraction and relaxation in failing human cardiomyocytes.</a> Circ Res. 127, 14-27 (2020).</li>
<li>Sandin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+simultaneous+laser+scanning+confocal+and+atomic+force+microscopy+%28conpokal%29+on+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Near simultaneous laser scanning confocal and atomic force microscopy (conpokal) on live cells.</a> J Vis Exp. (162), e61433(2020).</li>
<li>Castagnini, D., Palma, K., Jara Wilde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+Imaging+of+Proteus+mirabilis+biofilm+by+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Super-resolution Imaging of Proteus mirabilis biofilm by expansion microscopy.</a> J Vis Exp. (221), e67932(2025).</li>
<li>Wolf, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+live-cell+super-resolution+imaging+of+mitochondrial+cristae+and+quantification+of+submitochondrial+membrane+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Method for live-cell super-resolution imaging of mitochondrial cristae and quantification of submitochondrial membrane potentials.</a> Methods Cell Biol. 155, 545-555 (2020).</li>
<li>Wu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+perylene+carboximide+fluorophores+for+live-cell+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Near-infrared perylene carboximide fluorophores for live-cell super-resolution imaging.</a> J Am Chem Soc. 146, 7135-7139 (2024).</li>
<li>Pfanzelter, J., Mostowy, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+suppress+the+release+of+vaccinia+virus+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Septins suppress the release of vaccinia virus from infected cells.</a> J Cell Biol. 217, 2911-2929 (2018).</li>
<li>Kolossov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airyscan+super-resolution+microscopy+of+mitochondrial+morphology+and+dynamics+in+living+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Airyscan super-resolution microscopy of mitochondrial morphology and dynamics in living tumor cells.</a> Microsc Res Tech. 81, 115-128 (2018).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+macrophages+monitor+and+remove+particles+from+urine+to+prevent+tubule+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Renal macrophages monitor and remove particles from urine to prevent tubule obstruction.</a> Immunity. 57, 106-123 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Células COS7</td><td>ATCC (ou similar)</td><td>CRL-1651</td><td>Linha celular de fibroblastos renais do macaco verde africano. Usado para preparação de amostras de célula fixa para imagens multicoloridas de superresolução &nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; IgG anti-rato Donkey, conjugado Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen (ou similar)</td><td>A10037</td><td>Anticorpo secundário para coloração de microtúbulos. Usado com diluição 1:500</td></tr><tr><td>&nbsp; Dulbecco' s Meio Eagle Modificado (DMEM), glicose alta</td><td>Gibco (ou similar)</td><td>11965092</td><td>Meio de cultivo padrão para células COS7, suplementado com FBS de 10%.</td></tr><tr><td>&nbsp; Soro Fetal Bovino (FBS), inativado por calor</td><td>Gibco (ou similar)</td><td>10082147</td><td>Suplemento sérico usado a 10% (v/v) em todos os meios de cultura celular.</td></tr><tr><td>&nbsp; Prato de imagem com fundo de vidro (35 mm, &micro-Dish, #1.5 capa de polímero, 0,17 mm de espessura)</td><td>ibidi (ou similar)</td><td>81156</td><td>Substrato para placagem celular e imagem. Crítico para compatibilidade com objetivos de imersão em óleo de alto NA.</td></tr><tr><td>&nbsp; Processamento de imagem e software de análise (módulos ZEN)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>ZEN 3.5 (azul)</td><td>Usado para reconstrução 3D, processamento de superresolução (por exemplo, Processamento Airyscan), medição de PSF e análise SNR.</td></tr><tr><td>&nbsp; ImageJ / Fiji</td><td>Código Aberto</td><td>N/A</td><td>Usado para reconstrução 3D adicional, geração de vistas ortogonais e análise geral de imagens.</td></tr><tr><td>&nbsp; Óleo de imersão (Índice de refração = 1,518)</td><td>Carl Zeiss (ou similar)</td><td>444960-0000-000</td><td>Para uso com objetivos de imersão em óleo (por exemplo, 63x/1,4 NA).</td></tr><tr><td>&nbsp; Sistema de microscópio confocal de varredura a laser com detector de matriz multiplex (por exemplo, ZEISS LSM 900 com Airyscan 2)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 900 (Airyscan 2)</td><td>A principal plataforma de imagem usada para todos os modos confocais e super-resolução descritos no protocolo.</td></tr><tr><td>&nbsp; Médio Essencial Mínimo (MEM) com Earle' s Salts</td><td>Gibco (ou similar)</td><td>11095080</td><td>Meio de cultivo padrão para células Hep3B, suplementado com 10% de FBS.</td></tr><tr><td>&nbsp; Anticorpo monoclonal anti-alfa-tubulina de camundongo (Clone DM1A)</td><td>Sigma-Aldrich (ou similar)</td><td>T6199</td><td>Anticorpo primário para marcar microtúbulos. Usado com diluição 1:500</td></tr><tr><td>&nbsp; Paraformaldeído (PFA), 4% no PBS</td><td>&nbsp; Jinpan&nbsp; (ou similar)</td><td>TBS5083</td><td>Fixador para células. Use em temperatura ambiente por 15 minutos. Manuse-se com as precauções adequadas.</td></tr><tr><td>&nbsp; Meio de Imagem Livre de Fenol Vermelho</td><td>Gibco (ou similar)</td><td>21063029</td><td>Meio de baixa autofluorescência usado para imagem de células vivas. Pré-equilibrado com 5% de CO2 a 37&deg; C antes do uso.</td></tr><tr><td>&nbsp; Soro salino tamponado com fosfato (PBS), 1X, pH 7,4</td><td>CellWorld (ou similar)</td><td>C0162-311</td><td>Usado como buffer de lavagem e diluição durante todo o protocolo.</td></tr><tr><td>&nbsp; Montagem antifade dourada ProLong</td><td>Invitrogen (ou similar)</td><td>P36930</td><td>Meio de montagem endurecido para preservar a fluorescência em amostras fixas.</td></tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (ou similar)</td><td>T8787</td><td>Usado a 0,1% (v/v) para permeabilização celular</td></tr><tr><td>&nbsp; Pré-adolescente-20</td><td>Sigma-Aldrich (ou similar)</td><td>P9416</td><td>Usado a 0,05% (v/v) no PBS (PBST) para etapas de lavagem após incubações de anticorpos.</td></tr><tr><td>Albumina sérica bovina (BSA), Fração V</td><td>Sigma-Aldrich (ou similar)</td><td>A7906</td><td>Usado a 1% (p/v) no PBS para bloqueio e como componente do buffer de diluição de anticorpos.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Sigma-Aldrich (ou similar)</td><td>D9542</td><td>Contra-tinção nuclear. Usado em concentração final de 1 & micro; g/mL.</td></tr><tr><td>IgG anti-coelho do burro, conjugado Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen (ou similar)</td><td>A21206</td><td>Anticorpo secundário para coloração mitocondrial. Usado com diluição 1:500</td></tr><tr><td>Microsferas fluorescentes (Beads), 100 nm de diâmetro</td><td>Invitrogen (por exemplo, TetraSpeck&trade;) ou similares</td><td>T7279</td><td>Usado para medição empírica do sistema' função de espalhamento de pontos (PSF) e resolução.</td></tr><tr><td>Células Hep3B expressando de forma estável EGFP-mitocôndrias</td><td>IMMOCELL</td><td>IM-H367</td><td>Linha celular de hepatoma humana projetada para expressar estabilidade EGFP direcionada à matriz mitocondrial. Usado para imagens time-lapse de células vivas.</td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES, 1 M</td><td>Gibco (ou similar)</td><td>15630080</td><td>Usado em concentração final de 25 mM em meio de imagem para estabilização do pH durante imagens ao vivo fora de uma incubadora de CO2.</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura de alta precisão (#1,5, 0,17 mm de espessura)</td><td>Marienfeld (ou similar)</td><td>107052</td><td>Usado para montar amostras fixas.</td></tr><tr><td>Software operacional para microscópio (por exemplo, edição azul ZEN)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>ZEN 3.5 (azul)</td><td>Usado para controle do sistema, aquisição de imagens e processamento básico.</td></tr><tr><td>Lente objetiva: Plan-apochromat 63x/1.40 NA Oil DIC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>421462-9900-000</td><td>Objetivo principal usado para imagens de alta resolução.</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonal anti-TOMM20 do coelho</td><td>Abcam (ou similar)</td><td>ab186735</td><td>Anticorpo primário para marcar mitocôndrias. Usado com diluição 1:1000 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

imagem de superresolução e gerenciamento compartilhado: um protocolo para microscopia confocal com detecção de multiplex

Super-Resolution Imaging and Shared Management: A Protocol for Confocal Microscopy with Multiplex Detection

Imagem de Superresolução e Gerenciamento Compartilhado: Um Protocolo para Microscopia Confocal com Detecção de Multiplex

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