Fluxo de trabalho de criotomografia eletrônica para tecidos espessos demonstrado em hipocampo de camundongos

Minha pesquisa foca em estabelecer um fluxo de trabalho padronizado de crio-ET para permitir a análise estrutural in situ de tecidos espessos como o hipocampo do camundongo. Métodos existentes não têm confiabilidade para tecidos espessos, então esse protocolo integra etapas otimizadas para análise padronizada. Para começar, coloque uma gota de 10 L de solução 10% de sacarose sobre uma superfície de vidro limpa.

Dissecar rapidamente o hipocampo de um rato recém-eutanasiado. Usando uma lâmina afiada, retire pequenos pedaços de tecido de 0,5 a 1 milímetro cúbico. Usando um palito de dente ou escova fina, transfira o tecido para as grades TEM de suporte de cobre preparadas dentro do suporte de congelação de alta pressão.

Use 2-metilpentano para manter o tecido úmido e ajuste sua posição na grade, minimizando o estresse mecânico para evitar danos na grade. Depois, cubra o tecido e a grade com um disco de folha de cobre de 3 milímetros de diâmetro. Para completar a montagem, coloque o segundo suporte de congelamento de alta pressão, com o lado plano para baixo, por cima para formar um sanduíche de waffle lacrado.

E verifique os parâmetros de congelamento para garantir que não haja anomalias no instrumento. Certifique-se de que o tempo total desde a dissecação do tecido até o congelamento não exceda 90 segundos. Obter uma nova grade dourada de 300 malhas para servir como a grade receptora final para o procedimento de levantamento.

Sob um microscópio estereoscópico em temperatura ambiente, prenda suavemente a grade em um anel AutoGrid crio-FIB compatível. Depois, armazene o AutoGrid montado diretamente em um forno seco, mantido a aproximadamente 40 graus Celsius, para minimizar o acúmulo de geada antes do uso. Enquanto imerge continuamente o conjunto em nitrogênio líquido, separe cuidadosamente a grade TEM vitrificada dos componentes do conjunto de waffles ao redor.

Usando pinças pré-resfriadas de ponta fina, separe delicadamente os dois suportes de congelamento de alta pressão. Em seguida, em uma estação de trabalho pré-refrigerada com crio-carregamento, monte a grade de tecido isolada em um segundo anel AutoGrid crio-FIB sob proteção de nitrogênio líquido. Carregue ambos os AutoGrids nos slots designados do suporte de amostras do ônibus crio-transferido.

Oriente cada AutoGrade de modo que a entalhe de fresagem fique voltada para fora e posicionada verticalmente para permitir um ângulo de fresagem menor. Mantenha o ônibus totalmente carregado imerso em nitrogênio líquido ou em estado pré-resfriado até a transferência para o FIB-SEM. Carregue o estágio de amostra no instrumento usando a haste de amostra.

Após a criotransferência para o microscópio, navegue até a grade de tecido com baixa ampliação de SEM. Depois, faça uma camada de platina na superfície da grade a 30 miliamperes por 15 segundos para fornecer proteção condutiva. Deposite uma tampa organometálica de platina com espessura de 0,5 a 1,0 micrômetro usando o sistema de injeção de gás por aproximadamente 60 segundos.

Aplique uma camada final de platina revestida por sputter na superfície da grade a 30 miliamperes por 15 segundos. Usando a imagem do feixe de elétrons do MEB, navegue até a região selecionada de interesse na grade tecidual. Para orientar a amostra para fresagem frontal, ajuste o estágio para aproximadamente 110 graus de rotação e 7 graus de inclinação para apresentar a superfície da amostra em um ângulo adequado para acesso ao feixe de íons.

Para fresagem de trincheira, defina uma trincheira retangular ao redor do bloco de tecido alvo usando o feixe de íons operado a 30 quilovolts. Comece a fresar a uma distância do bloco usando uma corrente relativamente alta de 15 nanoamperes para alcançar a rápida remoção do material. À medida que as paredes da vala se aproximam do bloco com precisão de alguns micrômetros, reduza a corrente do feixe de íons para 7 nanoamperes para alcançar um controle de fresagem mais preciso.

Deixe um lado do bloco preso ao material a granel para criar uma aba temporária de fixação. Para blocos de tecido com espessura estimada maior que 20 micrômetros, execute uma etapa de fresagem por baixo pelo lado reverso para facilitar a elevação final. Gire o palco e ajuste a inclinação para acessar a parte inferior do bloco.

Frese a conexão inferior usando o feixe de íons focalizado a 30 quilovolts e uma corrente de 3 nanoamperes. Mouse a parte inferior do bloco metálico para encaixar firmemente contra o bloco da amostra. Frese com precisão a superfície de contato entre a amostra e o bloco de ouro para tornar o contato mais apertado.

Para fixar a amostra à agulha, certifique-se de que o bloco de ouro esteja em contato direto com a amostra-alvo. Usando o feixe de íons focados a 30 quilovolts e 0,5 nanoampere, realize de 8 a 12 padrões sequenciais de fresagem de seção transversal na interface para soldar o bloco de ouro à amostra. Para retirar o bloco de tecido, corte a aba restante que conecta o bloco à amostra em massa usando o feixe de íons focado.

Manobre cuidadosamente a agulha do micromanipulador para levantar o bloco de tecido isolado completamente fora da trincheira e da grade ao redor. Retraia a agulha e transporte o bloco até a grade do receptor. Navegue pela agulha do micromanipulador até uma grade de receptor dourada pré-resfriada de 300 malhas.

Baixe o bloco em um quadrado escolhido na grade. Moa pequenos cristais de gelo na grade para que o bloco de tecido e a grade aderam mais firmemente. Abaixe o bloco de tecido para que ele toque diretamente a grade.

Moa uma fatia de 3 a 4 micrômetros de espessura do bloco para o filme da grade usando o feixe de íons. Em seguida, solde a fatia de forma segura por fresação, usando padrões de seção transversal de limpeza em ambos os lados da junção, e reaplique o revestimento condutor e protetor na superfície da grade, como demonstrado anteriormente. Para o afinamento das lamelas, após definir a inclinação do palco, defina a posição final da lamela dentro de uma área lisa do bloco de tecido.

Realize fresagem sistemática usando correntes de feixe de íons e compensações de sobreinclinação especificadas na tabela apresentada. Quando estiver dentro de 1 a 2 micrômetros da lamela, opcionalmente frese uma vala de alívio de tensão a aproximadamente 1,5 micrômetros de distância para evitar a dobra ou o enrolamento da lamela. Após a preparação da lamela, adquira imagens usando criomicroscopia eletrônica.

Blocos de tecido processados por congelamento de alta pressão com o método waffle apresentavam uma aparência uniforme e transparente ao elétron. Tomografias reconstruídas resolveram estruturas mitocondriais no ambiente celular. Complexos macromoleculares, como ribossomos, foram claramente resolvidos no citoplasma.

Características celulares associadas ao citoesqueleto e à membrana, além de complexos porosos nucleares, também foram visíveis nos tomogramas reconstruídos. Estruturas e características sinápticas, incluindo reservas de cálcio e estruturas da bainha de mielina, foram claramente observadas nos tomografias. Esse protocolo permite que pesquisadores estudem a estrutura externa celular nativa diretamente em ambientes teciduais complexos.

O desafio mais crítico neste protocolo crio-ET é alcançar a vitrificação uniforme e livre de artefatos de amostras de tecido espesso. Seguindo esse procedimento, os pesquisadores podem localizar regiões de interesse usando microscopia correlativa de luz e eletrônica ou técnicas de marcação, e então realizar a média subtomográfica e análise estrutural para resolver complexos macromoleculares.