Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore
July 7th, 2026
O estudo atual descreve um fluxo de trabalho para sequenciamento nanoporoso de plasmídeos quando a sequência cromossômica já é conhecida ou não tem interesse. Uma etapa inicial de enriquecimento de DNA plasmídico garante a profundidade ótima da sequência plasmídica e maximiza o número de amostras que podem ser sequenciadas por célula de fluxo.
Investigamos a replicação, manutenção e disseminação de elementos circulares de DNA autorreplicantes, conhecidos como plasmídeos, o que exige a determinação de suas sequências. Este protocolo aborda questões de cobertura e precisão associadas à sequenciação de leitura longa, enriquecendo o DNA plasmídeo e otimizando os métodos de montagem. Nosso protocolo é projetado para sequenciar plasmídeos em situações em que a sequência cromossômica é conhecida ou irrelevante.
Para começar, espalhe as amostras em placas de LB com o antibiótico apropriado para selecionar o marcador de resistência transportado pelo plasmídeo respectivo. Incube as placas a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, inocule três a cinco mililitros de meio LB suplementado com o antibiótico apropriado com uma única colônia isolada.
Incube a cultura com agitação a 37 graus Celsius por aproximadamente oito horas ou até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja um a dois. Em seguida, inocule 400 mililitros de meio LB suplementado com o antibiótico apropriado com 400 microlitros da cultura iniciadora e incube conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, transfira a cultura para frascos de centrífuga apropriados para o volume da cultura.
Centrifuge a 4.200 G por 10 minutos e ressuspenda o pellet usando os volumes de reagente recomendados pelo fabricante. Após a lise celular e neutralização, centrifugue o lisado a 4.200 G por 30 minutos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e centrifugue-o novamente.
Realize a equilibração, lavagem e eluição de DNA de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, ressuspenda o DNA precipitado em 100 microlitros de água livre de nuclease para maximizar a concentração para a preparação da biblioteca de nanoporo. Em seguida, para quantificar o DNA, prepare os tubos de ensaio conforme a tabela apresentada.
Após calibrar o fluorômetro, insira os tubos de amostra no fluorômetro e registre as leituras de acordo com o manual do instrumento. Programe o ciclotermo para 30 graus Celsius por dois minutos, seguido de 80 graus Celsius por dois minutos. Gire e misture os componentes do kit descongelado conforme a tabela apresentada.
Incube os tubos de PCR preparados para codificação de barras usando o programa do ciclotermo. Em seguida, coloque os tubos no gelo para resfriar. Agrupe as amostras codificadas por barras em um tubo Eppendorf limpo de 1, 5 mililitros, garantindo que o volume total não exceda 1.000 microlitros.
Uma vez que as contas são vortexadas, adicione um volume igual de contas às amostras codificadas por barras agrupadas. Misture abanando o tubo, seguido de uma incubação de 10 minutos. Em seguida, lave as contas com um mililitro de 80% de etanol enquanto estão no ímã.
Remova o etanol e repita uma vez. Remova o tubo do ímã. Ressuspenda as contas no tampão de eluição usando o volume apropriado com base no número de códigos de barras em uso e incube por 10 minutos à temperatura ambiente.
Quantifique a concentração de DNA usando um microlitro da amostra eluida no fluorômetro para confirmar a preparação bem-sucedida da biblioteca. Para a ligação do adaptador, transfira 11 microlitros da biblioteca de DNA para um novo tubo e rotule-o. Em seguida, misture os componentes apresentados em um tubo fresco para diluir o adaptador rápido descongelado.
Em seguida, adicione um microlitro de adaptador rápido diluído aos 11 microlitros da biblioteca de DNA e abanar o tubo para misturar o conteúdo. Gire o tubo brevemente para garantir que o volume completo se reúna no fundo e incube o tubo no banco por cinco minutos. Prepare a mistura de inicialização da célula de fluxo em um tubo de DNA fresco e misture por inversão e pipetagem.
Levante a tampa do dispositivo e insira a célula de fluxo nela, aplicando pressão suave para garantir a colocação adequada. Após verificar se há bolhas de ar dentro ou adjacentes à porta de inicialização, retire 20 a 30 microlitros de fluido para remover as bolhas. Em seguida, aspire 800 microlitros de mistura de inicialização e dispense-a na porta de inicialização, evitando bolhas de ar, e deixe o dispositivo repousar por cinco minutos.
Misture a biblioteca de DNA com o volume apropriado de contas de biblioteca em um novo tubo, conforme apresentado aqui. Carregue 200 microlitros de mistura de inicialização na porta de inicialização da célula de fluxo. Ajuste a tampa da porta da amostra para revelar a porta.
Dispensando 75 microlitros da biblioteca de DNA com contas na porta da amostra, uma gota de cada vez, permitindo que cada gota absorva antes de adicionar a próxima. Em seguida, reaplique a tampa da porta da amostra e feche a porta de inicialização. Uma vez que a tampa do dispositivo esteja fechada, comece a execução da sequenciação.
Defina o limite de tempo com base no número de plasmídeos sendo multiplexados, com um padrão de 48 horas e um máximo de 72 horas. Selecione o modo de chamada de base super preciso e a opção de kit de código de barras rápido apropriada. Em seguida, selecione os dados FAST5 ou POD5 brutos e inicie a chamada de base.
Para gerar um arquivo FASTQ filtrado para montagem posterior, aplique trim em leituras longas usando Filtlong para remover aproximadamente 5-10% das leituras de menor qualidade, mantendo aproximadamente 90% do rendimento total. Subsampleie as leituras usando Autocycler de acordo com as configurações recomendadas. Monte cada subconjunto de leituras usando Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler e outros assemblers selecionados.
Visualize cada arquivo de gráfico de montagem usando bandage. Avalie os contigs quanto à circularidade, consistência de tamanho entre assemblers e evidência de juntas quiméricas. Remova os contigs lineares que não têm suporte em vários assemblers e mantenha os contigs circulares com estimativas de tamanho consistentes.
Remova os contigs secundários não suportados antes da geração do consenso quando os plasmídeos principais são circularizados. Prossiga para a geração de consenso após a curadoria manual. Gere a sequência de consenso usando Autocycler com as montagens curadas.
Execute os comandos restantes do Autocycler para produzir a sequência final do plasmídeo consenso. Por fim, polir a montagem final usando leituras longas aparadas com Medaka para melhorar a precisão do consenso. Todos os ensaios de conjugação produziram transconjugantes, confirmando a presença de um plasmídeo conjugativo nos doadores.
Os tamanhos das sequências de plasmídeos montados eram congruentes com as estimativas baseadas na mobilidade da eletroforese em campo pulsado. A sequenciação de nanoporo produziu saída de leitura e qualidade suficientes para todas as amostras analisadas. As taxas de contaminação cromossômica variaram entre 72, 1% e 28, 0%, com uma média de 46, 9%. A análise de eletroforese em campo pulsado do plasmídeo da cepa UPEC_271 revelou uma banda correspondente a um plasmídeo de aproximadamente 145 quilobases pares.
O DNA de um dos transconjugantes mostrou uma sequência idêntica às 145 quilobases. A análise de eletroforese em campo pulsado da cepa blood 100913 identificou dois plasmídeos de aproximadamente 70 e 110 quilobases pares. A seque
Overview
This article presents a detailed workflow for nanopore sequencing aimed at maximizing plasmid DNA yield and sequencing accuracy. The protocol encompasses plasmid extraction, rapid barcoding, adapter ligation, sequencing, and sequence assembly, and is suitable for a wide range of plasmid sizes and levels of chromosomal contamination. The method is demonstrated using Escherichia coli as a model organism.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- Genomics
- Microbiology
Background
- Plasmid sequencing is essential for genetic studies, recombinant gene expression, and plasmid capture experiments.
- Traditional sequencing methods may be limited by chromosomal contamination and low plasmid yield.
- Nanopore sequencing offers long-read capabilities and real-time data acquisition.
- Efficient workflows are needed to optimize plasmid sequencing throughput and accuracy.
Purpose of Study
- To develop and describe a robust workflow for nanopore-based plasmid sequencing.
- To maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy.
- To enable efficient parallel sequencing of multiple samples.
Methods Used
- Plasmid DNA extraction from clinical E. coli strains.
- Library preparation using rapid barcoding and adapter ligation.
- Loading libraries onto a nanopore flow cell for sequencing.
- Base calling performed in real time or post-hoc.
- Sequence assembly using Autocycler.
- Comparison of assemblies to gel mobility and short-read polished assemblies.
Main Results
- Plasmid assemblies matched sizes inferred from gel mobility.
- In two-thirds of cases, assemblies matched or closely resembled short-read polished assemblies (within 0.05% pairwise identity).
- Protocol supports plasmids from 4 to 174 kb in size.
- Up to 72% chromosomal contamination tolerated without loss of accuracy.
- Parallel sequencing of up to 24 samples achieved with optimal coverage.
Conclusions
- The workflow enables accurate and efficient plasmid sequencing using nanopore technology.
- It is suitable for plasmid verification, improving WGS-derived plasmid sequences, and sequencing plasmids captured by conjugation.
- The protocol is robust to chromosomal contamination and applicable to a range of plasmid sizes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Long-read nanopore plasmid sequencing enables high-confidence verification and assembly of plasmid constructs, supporting critical quality control and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This workflow addresses the challenge of chromosomal contamination and variable plasmid yield, providing robust, scalable solutions for recombinant DNA and gene therapy vector development. Its parallelization and tolerance for mixed DNA inputs streamline early discovery and preclinical workflows, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of engineered plasmids for functional studies and target validation.
- Reduces ambiguity in construct identity, supporting mechanistic de-risking in discovery biology.
- Facilitates rapid triage of candidate constructs for downstream screening or expression.
Screening & Assay Development
- Provides validated sequence data for assay-ready plasmids, ensuring reproducibility in screening campaigns.
- Supports parallel sequencing of up to 24 samples, increasing throughput for construct libraries.
- Delivers quantitative sequence accuracy, enabling reliable comparison across engineered variants.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical studies by confirming plasmid integrity in disease-relevant systems.
- Enables sequence verification for plasmids used in gene delivery or biomarker studies.
- Supports risk-adjusted advancement by minimizing sequence-related uncertainties in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based workflow integrates from early construct verification through screening and preclinical validation, supporting both hypothesis-driven and translational research pipelines.
- Discovery Biology: Confirms plasmid sequence fidelity, reducing risk of off-target effects in functional assays.
- Screening: Ensures assay-ready constructs are sequence-verified, supporting reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides high-accuracy, quantitative sequence data for cross-sample comparison and quality control.
- Translational Research: Aligns plasmid sequence verification with preclinical model requirements for gene expression studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, parallelizable sequencing capability adaptable across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in construct-driven studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes plasmid verification, tolerates high chromosomal contamination, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring construct integrity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmid extraction, library preparation, and nanopore sequencing workflows.
- Demands computational infrastructure scaled to real-time or post-hoc basecalling needs.
- Benefits from standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to a range of plasmid sizes and host backgrounds, including high chromosomal DNA content.
- Best suited for applications where chromosomal sequence is known or not required.
