Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore
7 de julho de 2026
O estudo atual descreve um fluxo de trabalho para sequenciamento nanoporoso de plasmídeos quando a sequência cromossômica já é conhecida ou não tem interesse. Uma etapa inicial de enriquecimento de DNA plasmídico garante a profundidade ótima da sequência plasmídica e maximiza o número de amostras que podem ser sequenciadas por célula de fluxo.
Investigamos a replicação, manutenção e disseminação de elementos circulares de DNA autorreplicantes, conhecidos como plasmídeos, o que exige a determinação de suas sequências. Este protocolo aborda questões de cobertura e precisão associadas ao sequenciamento de leitura longa, enriquecendo DNA plasmídico e otimizando métodos de montagem. Nosso protocolo foi projetado para sequenciar plasmídeos em situações onde a sequência cromossômica é conhecida ou irrelevante.
Para começar, estrie as amostras em placas de parafuso LB suplementadas com o antibiótico apropriado para selecionar o respectivo marcador de resistência transmitido pelo plasmídeo. Incube as placas a 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, inocule de três a cinco mililitros de médio LB suplementado com o antibiótico apropriado com uma única colônia isolada.
Incube a cultura com agitação a 37 graus Celsius por aproximadamente oito horas ou até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja um a dois. Em seguida, inocule 400 mililitros de LB de meio suplementado com o antibiótico apropriado com 400 microlitros da cultura inicial e incube, como demonstrado anteriormente. Depois, transfira a cultura para frascos centrífugas apropriados para o volume da cultura.
Centrifuge a 4.200 G por 10 minutos e ressuspenda o pellet usando os volumes de reagentes recomendados pelo fabricante. Após a lise e neutralização celular, centrifuge o lisado a 4.200 G por 30 minutos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e centrifuge-o novamente.
Realize equilíbrio, lavagem e eluição de DNA conforme as instruções do fabricante. Depois, ressuspenda o DNA precipitado em 100 microlitros de água sem nuclease para maximizar a concentração e preparar a biblioteca de nanoporos. Em seguida, para quantificar o DNA, prepare os tubos de ensaio conforme a tabela apresentada.
Após calibrar o fluorômetro, insira os tubos da amostra no fluorômetro e registre as leituras conforme o manual do instrumento. Programe o ciclador térmico para 30 graus Celsius por dois minutos, seguido por 80 graus Celsius por dois minutos. Gire e misture os componentes descongelados do kit conforme a tabela apresentada.
Incube os tubos de PCR preparados para código de barras usando o programa de ciclador térmico. Depois, coloque os tubos no gelo para esfriar. Agrupe as amostras com código de barras em um tubo Eppendorf limpo de 1,5 mililitros, garantindo que o volume total não ultrapasse 1.000 microlitros.
Depois que as contas estiverem em vórtice, adicione um volume igual de esferas às amostras agrupadas com código de barras. Misture batendo o tubo, seguido de uma incubação de 10 minutos. Depois, lave as esferas com um mililitro de etanol 80% enquanto estiver no ímã.
Remova o etanol e repita uma vez. Remova o tubo do ímã. Ressuspenda as esferas no buffer de elução usando o volume apropriado baseado no número de códigos de barras em uso e incube por 10 minutos em temperatura ambiente.
Quantifique a concentração de DNA usando um microlitro da amostra eludida no fluorômetro para confirmar a preparação bem-sucedida da biblioteca. Para a ligação do adaptador, transfira 11 microlitros da biblioteca de DNA para um novo tubo e o identifique. Depois, misture os componentes apresentados em um tubo novo para diluir o adaptador rápido descongelado.
Em seguida, adicione um micrólitro de adaptador rápido diluído à biblioteca de 11 microlitros de DNA e faça um movimento no tubo para misturar o conteúdo. Faça o tubo girar rapidamente para garantir que o volume total se acumule na base e incube o tubo na bancada por cinco minutos. Prepare a mistura de priming da célula de fluxo em um tubo de DNA novo e misture por inversão e pipeteamento.
Levante a tampa do dispositivo e insira a célula de fluxo nela enquanto aplica uma pressão suave para garantir a colocação correta. Após verificar se há bolhas de ar dentro ou ao lado da porta de preparação, retire de 20 a 30 microlitros de fluido para remover as bolhas. Depois, retire 800 microlitros de mistura de priming e dispense na porta de priming evitando bolhas de ar, e deixe o aparelho descansar por cinco minutos.
Misture a biblioteca de DNA com o volume apropriado de contas da biblioteca em um novo tubo, como apresentado aqui. Carregue 200 microlitros de mistura de priming na porta de priming da célula de fluxo. Ajuste a tampa da porta da amostra para revelar a porta.
Dispense 75 microlitros da biblioteca de DNA com esferas na porta da amostra, uma gota de cada vez, permitindo que cada gota seja absorvida antes de adicionar a próxima. Depois, reaplique a tampa da porta da amostra e feche a porta de priming. Assim que a tampa do dispositivo estiver fechada, inicie a execução de sequenciamento.
Defina o limite de tempo de execução com base no número de plasmídeos sendo multiplexados, com padrão de 48 horas e máximo de 72 horas. Selecione o modo de chamada de base super preciso e a opção de kit de código de barras rápido apropriada. Depois, selecione os dados brutos do FAST5 ou POD5 e comece a ligar para a base.
Para gerar um arquivo FASTQ filtrado para montagem a jusante, corte leituras longas usando Filtlong para remover aproximadamente 5-10% das leituras de menor qualidade, mantendo aproximadamente 90% do rendimento total. Subsample lê usando o Autocycler conforme as configurações recomendadas. Monte cada subconjunto de leitura usando Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler e outros montadores selecionados.
Visualize cada arquivo gráfico de montagem usando bandage. Avalie contigs quanto à circularidade, consistência de tamanho entre montadores e evidências de juntas quiméricas. Remova contigs lineares sem suporte entre múltiplos assemblers e mantenha contigs circulares com estimativas de tamanho consistentes.
Remova contigs menores sem suporte antes da geração de consenso quando os plasmídeos principais são circularizados. Prossiga para a geração de consenso após a curadoria manual. Gerar a sequência de consenso usando o Autocycler com os assemblies curados.
Execute os comandos restantes do Autocycler para produzir a sequência final de plasmídeo consensual. Por fim, polia a montagem final usando leituras longas e cortadas com Medaka para melhorar a precisão do consenso. Todos os ensaios de conjugação produziram transconjugantes, confirmando a presença de um plasmídeo conjugativo nos doadores.
Os tamanhos das sequências plasmídicas montadas foram congruentes com estimativas baseadas na mobilidade da eletroforese do gel de campo de pulso. O sequenciamento nanopore produziu leitura suficiente e qualidade para todas as amostras analisadas. As taxas de contaminação cromossômica variaram entre 72,1% e 28,0% com média de 46,9%. A análise de eletroforese em gel de campo pulso do plasmídeo de UPEC_271 revelou uma faixa correspondente a um plasmídeo de aproximadamente 145 pares de quilobases.
O DNA de um dos transconjugantes mostrou uma sequência idêntica às 145 kilobases. A análise de eletroforese em gel de campo pulsivo do 100913 sanguíneo de deformação identificou dois plasmídeos de aproximadamente 70 e 110 pares de quilobases. O sequenciamento por nanoporos confirmou duas assemblagens de plasmídeos de 71.182 pares de bases e 111.226 pares de bases.
A consideração mais importante é se a sequência cromossômica é de interesse. Se sim, protocolos padrão de sequenciamento do genoma completo são melhores. A maior cobertura do nosso protocolo abre a porta para o estudo da heteroplasmia, ou seja,
variação da sequência plasmídica dentro de uma dada população.
Visão Geral
Este artigo apresenta um fluxo de trabalho detalhado para sequenciamento por nanoporos, com o objetivo de maximizar o rendimento de DNA plasmidial e a precisão do sequenciamento. O protocolo abrange extração de plasmídeos, marcação rápida com códigos de barras, ligação de adaptadores, sequenciamento e montagem de sequências, sendo adequado para uma ampla variedade de tamanhos de plasmídeos e níveis de contaminação cromossômica. O método é demonstrado utilizando Escherichia coli como organismo modelo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia molecular
- Genômica
- Microbiologia
Antecedentes
- O sequenciamento de plasmídeos é essencial para estudos genéticos, expressão gênica recombinante e experimentos de captura de plasmídeos.
- Os métodos tradicionais de sequenciamento podem ser limitados pela contaminação cromossômica e baixo rendimento de plasmídeos.
- O sequenciamento por nanoporos oferece capacidade de leitura longa e aquisição de dados em tempo real.
- São necessários fluxos de trabalho eficientes para otimizar a produtividade e a precisão do sequenciamento de plasmídeos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver e descrever um fluxo de trabalho robusto para o sequenciamento de plasmídeos baseado em nanoporos.
- Maximizar o rendimento de DNA plasmidial e a precisão do sequenciamento.
- Permitir o sequenciamento paralelo eficiente de múltiplas amostras.
Métodos Utilizados
- Extração de DNA plasmidial de cepas clínicas de E. coli.
- Preparação da biblioteca utilizando barcodagem rápida e ligação de adaptadores.
- Carregamento das bibliotecas em uma flow cell de nanoporo para sequenciamento.
- Chamada de bases realizada em tempo real ou a posteriori.
- Montagem de sequências utilizando o Autocycler.
- Comparação das montagens com mobilidade em gel e montagens polidas com leituras curtas.
Resultados Principais
- Assembléias de plasmídeos compatíveis com os tamanhos inferidos pela mobilidade em gel.
- Em dois terços dos casos, as assembléias corresponderam ou se assemelharam estreitamente a assembléias polidas por leituras curtas (dentro de 0,05% de identidade par a par).
- O protocolo suporta plasmídeos com tamanho variando de 4 a 174 kb.
- Até 72% de contaminação cromossômica tolerada sem perda de precisão.
- Sequenciamento paralelo de até 24 amostras alcançado com cobertura ótima.
Conclusões
- O fluxo de trabalho permite o sequenciamento preciso e eficiente de plasmídeos usando a tecnologia nanoporo.
- É adequado para verificação de plasmídeos, melhoria de sequências de plasmídeos derivadas de WGS e sequenciamento de plasmídeos capturados por conjugação.
- O protocolo é robusto frente à contaminação cromossômica e aplicável a uma variedade de tamanhos de plasmídeos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O sequenciamento de plasmídeos com nanoporos de leitura longa permite a verificação e montagem de construtos plasmidiais com alta confiança, apoiando o controle crítico de qualidade e a redução de riscos mecanicistas em pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico. Este fluxo de trabalho aborda o desafio da contaminação cromossômica e do rendimento variável de plasmídeos, fornecendo soluções robustas e escaláveis para o desenvolvimento de DNA recombinante e vetores de terapia gênica. Sua capacidade de paralelização e tolerância a entradas de DNA mistas agilizam os fluxos de trabalho iniciais de descoberta e pré-clínicos, aprimorando a tomada de decisões no portfólio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a verificação precisa de plasmídeos projetados para estudos funcionais e validação de alvos.
- Reduz a ambiguidade na identidade do construto, apoiando a eliminação de riscos mecanicistas na biologia de descoberta.
- Facilita o triagem rápido de construtos candidatos para triagem subsequente ou expressão.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece dados de sequência validados para plasmídeos prontos para ensaio, garantindo reprodutibilidade em campanhas de triagem.
- Permite o sequenciamento paralelo de até 24 amostras, aumentando a produtividade para bibliotecas de construtos.
- Oferece precisão quantitativa da sequência, permitindo comparações confiáveis entre variantes modificados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Aprimora a continuidade do descobrimento até estudos pré-clínicos ao confirmar a integridade do plasmídeo em sistemas relevantes para a doença.
- Permite a verificação de sequência para plasmídeos utilizados em estudos de entrega gênica ou de biomarcadores.
- Apoia o avanço ajustado ao risco ao minimizar incertezas relacionadas à sequência em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho baseado em nanoporos integra desde a verificação inicial do construto até a triagem e validação pré-clínica, apoiando tanto pesquisas baseadas em hipóteses quanto pipelines de pesquisa translacional.
- Biologia de Descoberta: Confirma a fidelidade da sequência do plasmídeo, reduzindo o risco de efeitos fora do alvo em ensaios funcionais.
- Triagem: Garante que os construtos prontos para ensaio tenham suas sequências verificadas, apoiando a avaliação reprodutível de compostos.
- Análises: Fornece dados quantitativos de sequência com alta precisão para comparação entre amostras e controle de qualidade.
- Pesquisa Translacional: Alinha a verificação da sequência do plasmídeo aos requisitos dos modelos pré-clínicos para estudos de expressão gênica.
- Reutilização Corporativa: Oferece uma capacidade de sequenciamento escalável e paralelizável, adaptável a diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos baseados em construtos e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Padroniza a verificação de plasmídeos, tolera alta contaminação cromossômica e suporta fluxos de trabalho de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de prosseguir ou não ao garantir a integridade do construto antes de investimentos posteriores.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de ativos baseados em genes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em extração de plasmídeos, preparação de bibliotecas e fluxos de trabalho de sequenciamento nanoporo.
- Exige infraestrutura computacional dimensionada para necessidades de chamada de bases em tempo real ou pós-análise.
- Beneficia-se de protocolos padronizados para reprodutibilidade entre equipes e comparabilidade de dados.
- Adaptável a uma variedade de tamanhos de plasmídeos e backgrounds de hospedeiros, incluindo alto conteúdo de DNA cromossômico.
- É mais adequado para aplicações em que a sequência cromossômica é conhecida ou não necessária.
