Name: Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a sequenciar e montar plasmídeos usando nanopore com extração, codificação por barra e ligação de adaptadores. Este protocolo demonstrado em Escherichia coli maximiza o rendimento de DNA e a precisão da montagem.

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<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf DNA LoBind tube</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP022431081</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>1.5 mL tube racks</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-313630</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>FALCON</td><td>352096</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>15 mL tube racks</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8850</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>2.0 mL microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-138</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>250 mL sterile flasks&nbsp;</td><td>PYREX</td><td>5320</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>C-103-50</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5424R-PR-R</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810R-P-R</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Centrifuge bottles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B1283-4EA</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Disposable Inoculating Loops: 1 &micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-595</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Electronic Digital Scale</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-2001</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>04-355-720</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Ethanol-resistant markers</td><td>Sharpie</td><td>37001; 37002; 37003</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Flow cell (R10.4.1)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell Wash Kit&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH004</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>X-GEN</td><td>44-100M</td><td>Qualquer marca de luvas de nitrilo funciona</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>432128</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP26184</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>MinION Sequencing Device&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MIN-101B</td><td></td></tr><tr><td>Native Barcoding Kit 96 V14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-NBD114.96</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra MIDI Plasmid DNA Extraction Kit</td><td>Takara</td><td>740410.5</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube racks</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>&nbsp;R96PCRFSP</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>PCR tubes: (0.2 mL)</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>PCR-02-C</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Program autocycler v0.5.2</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program bcftools v1.22</td><td>Wellcome Sanger Institute (HTSlib / Samtools team)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program bwa v0.7.19</td><td>Heng Li, originally at the Broad Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program canu v2.3</td><td>University of California, Davis &amp; Pacific Biosciences collaborators</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program flye v2.9.6</td><td>University of California, San Diego (Pavel Pevzner lab)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program medaka v2.1.1</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program metamdbg&nbsp;v1.2</td><td>INRIA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program miniasm v0.3</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program minimap2 v2.28</td><td>Heng Li</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program minipolish&nbsp; v0.2.0&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;&nbsp;</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program porechop v0.2.4</td><td>Ryan Wick / University of Melbourne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program racon v1.5.0</td><td>Genome Institute of Singapore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program samtools v1.22.1</td><td>Wellcome Sanger Institute (HTSlib / Samtools project)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; 4 Fluorometer</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; Assay Tubes</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Barcoding Kit 24 and 96 V14&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>SQK-RBK114.96</td><td></td></tr><tr><td>Set of micropipettes that dispense between 1 &ndash; 10 &mu;L (P10), 2 &ndash; 20 &mu;L (P20), 20 &ndash; 200 &mu;L (P200) and 200 &ndash; 1000 &mu;L (P1000)</td><td>RAININ</td><td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td><td>Micropipettes devem ser calibradas</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>335905P</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Sterilized tips for 10 &mu;L, 200 &mu;L and 1000 &mu;L&nbsp;</td><td>Eclipse</td><td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000 Touch&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221052</td><td>Pode ser substituído por outra marca</td></tr></tbody></table>

sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore

Long-Read Plasmid Sequencing and Assembly Using Nanopore Sequencing-Based Workflows

Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore

The present study describes a workflow for nanopore sequencing designed to maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy. Researchers cover each step ...

long-read-plasmid-sequencing-assembly-using-nanopore-sequencing-based

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Nanopore tecnologia de sequenciamento biomoléculas tem amplas aplicações nas ciências da vida, incluindo a identificação de patógenos, monitorização da segurança dos alimentos, análise genômica, monitoramento ambiental metagenomic e caracterização de bactérias resistência aos antibióticos. Neste artigo, o processo de sequenciamento de DNA de solo metagenomic para identificação de espécies, usando a tecnologia de sequenciamento de nanopore é demonstrado.

Sequenciamento de DNA Nanopore para análise de solo Metagenomic

Long-leitura sequências facilitam grandemente a montagem de genomas complexas e caracterização da variação estrutural. Nós descrevemos um método para gerar as sequências ultra-longa pelas plataformas de sequenciamento baseado em nanopore. A abordagem adota uma extração de DNA otimizada seguida de preparações de biblioteca modificada para gerar centenas de mil leituras com cobertura moderada de células humanas.

Sequenciamento de leitura ultralonga para análise de DNA genômico completo

O sequenciamento de nanopore é uma nova tecnologia que permite o sequenciamento econômico em locais remotos e configurações pobres em recursos. Aqui, nós apresentamos um protocolo para arranjar em seqüência dos mRNAs do sangue inteiro que é compatível com tais circunstâncias.

Sequenciamento de mRNA de sangue total usando sequenciamento de nanoporos

Nós validamos anteriormente um protocolo para sequenciamento do vírus Usutu (USUV) baseado em amplicon em uma plataforma de sequenciamento de nanoporos. Aqui, descrevemos os métodos usados com mais detalhes e determinamos a taxa de erro da célula de fluxo Nanopore R10.

Validando o sequenciamento de nanoporos de genoma inteiro, usando o vírus Usutu como exemplo

Este protocolo detalha uma abordagem abrangente para a montagem de um genoma híbrido de bactérias urinárias. Fornece um procedimento reprodutível para a geração de sequências completas de genomas circulares úteis no estudo de elementos genéticos cromossômicos e extracromosômicos que contribuem para a colonização urinária, patogênese e disseminação de resistência antimicrobiana.

Montagem híbrida de genoma de Novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho rápido e econômico para caracterizar genomas do vírus da raiva (RABV) usando a tecnologia de nanoporos. O fluxo de trabalho destina-se a apoiar a vigilância genômica informada em nível local, fornecendo informações sobre linhagens RABV circulantes e sua colocação dentro de filogenias regionais para orientar medidas de controle da raiva.

Sequenciamento do Genoma Completo para Caracterização Rápida do Vírus Rábico Utilizando Tecnologia de Nanoporos

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de culturas de células ex vivo ou in vitro para pré-processamento de dados transcriptômicos para triagem de drogas baseada em transcriptoma custo-efetivo.

Triagem Transcriptomic-Based Drug Screening Custo-Eficiente

A montagem in vivo é um método de clonagem independente de ligação que depende de enzimas intrínsecas de reparo de DNA em bactérias para montar fragmentos de DNA por recombinação homóloga. Este protocolo é eficaz em termos de tempo e custo, uma vez que são necessários poucos reagentes e a eficiência da clonagem pode chegar aos 99%.

Uso de montagem in vivo para construção de plasmídeo de alta eficiência

Este protocolo foi otimizado para sequenciamento profundo direcionado de 18 regiões de resistência a medicamentos em Mycobacterium tuberculosis usando uma plataforma de sequenciamento de leitura longa, seguida de análise com um pipeline de bioinformática específico para tuberculose projetado para dados de leitura longa.

Sequenciamento de Amplicon usando as tecnologias de sequenciamento de leitura longa

sequenciamento de uma única célula é uma ferramenta cada vez mais popular e acessível para lidar com alterações genômicas em alta resolução. Nós fornecemos um protocolo que utiliza a sequenciação de célula única para identificar alterações no número de cópias em células individuais.

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Aprenda a sequenciar e montar plasmídeos usando nanopore com extração, codificação por barra e ligação de adaptadores. Este protocolo demonstrado em Escherichia coli maximiza o rendimento de DNA e a precisão da montagem.

Sequenciamento e montagem de plasmídeos de leitura longa usando fluxos de trabalho baseados em sequenciamento nanopore

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