Lactilação de Lisina Específica para Local via Expansão do Código Genético em E. coli e Células de Mamíferos

Desenvolvemos um sistema de clock/tRNA RS para superar mimetismo e limitações enzimáticas, permitindo a incorporação precisa da listina lactilada para estudar sua biologia. Este protocolo pode ser aplicado para estudar o metabolismo tumoral, funções enzimáticas e locais de clock. Para começar, co-transforme 50 microlitros de células quimicamente competentes de Escherichia coli DH10B com aproximadamente 100 nanogramas de cada plasmídeo desejado. Incube a mistura de transformação no gelo por 25 minutos e depois faça choque térmico a 42 graus Celsius por 45 segundos.

Volte o tubo ao gelo por três minutos. Adicione 350 microlitros de Luria bertani medium e agite vigorosamente o tubo a 220 rotações por minuto por uma hora a 37 graus Celsius. Agora espalhe a cultura celular transformada em uma placa de ágar Luria bertani suplementada com ampicilina e cloranfenicol.

Incube a placa a 37 graus Celsius por 12 a 16 horas. Depois, retire uma única colônia da placa para inocular uma cultura inicial de quatro mililitros e incube durante a noite. No dia seguinte, expanda a cultura durante a noite para 400 mililitros de meio de Luria bertani contendo ampicilina e cloranfenicol.

Agite vigorosamente a cultura a 220 rotações por minuto e 37 graus Celsius até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja entre 0,6 e 0,8. Em seguida, induza a cultura com 0,2% de L-Arabinose e uma lisina lactil milimolar e incube a 30 graus Celsius e 220 rotações por minuto por 16 horas. As células semente operam em uma placa de 12 poços com densidade de um vezes 10 elevado à potência de cinco células por poço, usando um mililitro de DMEM.

Incube por 24 horas até que a confluência celular atinja entre 70 e 80% e depois prossiga para a transfecção. Para preparar a solução de DNA diluído, adicione 0,75 microgramas de plasmídeo contendo repórter sfGFP e pNeu-KlacRS em proporção um-para-um em 38 microlitros de DMEM sem soro com glicose alta. Pipete suavemente para cima e para baixo ou faça um vórtice breve para misturar.

Para preparar o reagente de transfecção diluído, adicione 2,25 microlitros de reagente de transfecção em 38 microlitros de DMEM sem soro com alta glicose. Pipete suavemente para cima e para baixo três a quatro vezes para misturar bem. Adicione imediatamente o reagente de transfecção diluído à solução de DNA diluída de uma vez só.

Agora, pipete para cima e para baixo três a quatro vezes para misturar o conteúdo e incubar a solução em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos para permitir a formação dos complexos de transfecção e DNA. Adicione 50 microlitros do complexo de transfecção e DNA gota a gota sobre o meio em cada poço e gire suavemente a placa para homogeneizar a mistura. Seis horas após a transfecção, substitua o meio por DMEM fresco contendo uma lisina lactil milimolar e cultive as células por 24 a 48 horas.

Em Escherichia coli, hENO1-89Klac de comprimento total foi produzido quando uma lisina lactil milimolar foi adicionada ao meio de crescimento. A imunoblotting confirmou a presença de hENO1-89Klac de comprimento total usando anticorpos anti-His tag e anti-L-lactyl lisina. A espectrometria de massa do tempo de ionização por eletrospray revelou um pico dominante em 48.178 Daltons, correspondendo à massa esperada de hENO1-89Klac sem a metionina iniciadora.

A espectrometria de massa tandem da digestão do tríptico confirmou a incorporação específica do sítio de Klac no Residuo 89 por meio da presença de uma série completa de íons B&Y mapeando o peptídeo modificado. Em células HEK293T de mamíferos, a microscopia de fluorescência mostrou forte expressão de sfGFP em todas as células quando Klac foi adicionado por 24 horas e 48 horas, enquanto nenhuma fluorescência foi observada sem suplementação com Klac. A citometria de fluxo revelou que aproximadamente 31% das células expressaram sfGFP após 24 horas, aumentando para cerca de 37% após 48 horas de suplementação de Klac.

Esse protocolo permite a investigação dos efeitos específicos da lactilação da lisina na função proteica e facilita a medição dos resultados biológicos e funcionais resultantes. Após esse procedimento, os pesquisadores podem realizar estudos mecanicistas, realizar ensaios de triagem de alto rendimento e gerar linhagens celulares estáveis para análise funcional estendida. Nossos estudos futuros visam melhorar a eficiência, permitir integração estável e desenvolver a biossíntese de relógios.