Modelo de rato canulado com ducto linfático cervical para avaliação do transporte linfático da cabeça e do cérebro

Nosso projeto examina como os linfáticos cerebrais se relacionam com doenças do SNC, como Alzheimer, AVC e neuroinflamação, identificando substâncias que drenam do cérebro. Os métodos existentes careciam de um protocolo e de uma abordagem confiável para amostrar e quantificar teoricamente a saída linfática derivada do SNC, o que é possibilitado por esse protocolo. Para começar, pré-carregue aproximadamente 0,7 mililitros de solução anticoagulante diluída em uma seringa de insulina estéril de um mililitro com uma agulha de calibre 30 para revestir a superfície interna da cânula de polietileno.

Armazene a seringa pré-carregada em condições estéreis até o uso. Para preparar cânulas, utilize tubos com diâmetro externo de 0,5 milímetro e diâmetro interno de 0,3 milímetro para ambas as seções terminais e tubos externos de 0,6 milímetro e interno de 0,5 milímetro para a seção central. Usando tesoura, corte os segmentos da cânula em comprimentos de dois centímetros para a porção proximal que se conecta à agulha da seringa, 40 centímetros para a seção central e oito centímetros para a parte distal destinada à canulação.

Montar a cânula em configuração cabeça para cauda. Em seguida, corte e bisele a extremidade distal do conjunto da cânula em um ângulo de aproximadamente 45 graus para facilitar a inserção suave no ducto linfático cervical. Verifique a patência de cada cânula conectando a seringa pré-carregada à extremidade proximal da cânula montada.

Libere suavemente um pequeno volume de solução para lavar a cânula. Certifique-se de que a solução saia suavemente pela extremidade distal, sem evidências de vazamento. Posicione um rato anestesiado em deitado sobre uma almofada cirúrgica aquecida mantida a 37 graus Celsius.

Incline a cabeça e estenda o pescoço usando uma pequena almofada de suporte, se necessário, para aumentar a exposição da região cervical. Prenda suavemente os membros anteriores usando elásticos ou fitas cirúrgicas para minimizar o movimento. Enxágue o pelo da região cervical com soro fisiológico normal estéril para facilitar a depilação.

Depois, raspe cuidadosamente todo o local cirúrgico para garantir a remoção completa do pelo antes da incisão. Marque o local da cirurgia desenhando uma linha pontilhada de 2,5 centímetros para confirmar o comprimento da incisão inicial. Coloque a extremidade superior da incisão aproximadamente de um a 1,5 centímetro abaixo do lábio inferior.

Após confirmar a profundidade anestésica pelo reflexo de beliscão do dedo do pé, incisa cuidadosamente a camada superficial da musculatura cervical ao longo da linha marcada. Em seguida, separe suavemente as camadas musculares restantes, principalmente a fáscia cervical superficial, para expor a artéria cervical. Retrair o músculo esternomastoide e a glândula submandibular, inclinando-os para longe do campo cirúrgico para facilitar a identificação do ducto linfático cervical.

Use um expansor de tecido para manter a janela cirúrgica. Com um cotonete, segure temporariamente o tecido muscular enquanto localiza o linfonodo e o ducto linfático associado. Localize o ducto linfático cervical opaco e incolor que corre paralelo à artéria carótida.

Usando pinças contundentes, passe suavemente pelos tecidos conjuntivos separados e mantenha as pinças na posição. Isolar cuidadosamente o ducto linfático cervical dos tecidos conjuntivos e adiposos ao redor por dissecação romba. Depois, crie uma pequena incisão na metade superior do vaso exposto.

Uma pequena perfuração secundária na pele a aproximadamente 1,5 centímetro da janela cirúrgica pode ser criada para servir como ponto adicional de fixação para a cânula. Insira a cânula pela segunda abertura, segure sua extremidade distal com pinças e certifique-se de que sua face chanfrada esteja direcionada para cima. Depois, insira suavemente a extremidade distal aproximadamente dois milímetros dentro do ducto linfático através da incisão, orientando-a em direção à cabeça.

Monitore a extremidade proximal da cânula por um a dois minutos. Confirme a canulação bem-sucedida observando uma saída lenta e constante de líquido linfático. Fixe a cânula aplicando uma pequena gota de adesivo de tecido cianoacrilato com uma pipeta no local da incisão e no orifício de fixação secundário.

Observe o fluxo linfático por vários minutos para confirmar o fluxo constante de saída. Depois, remova cuidadosamente o expansor de tecido e reposicione a glândula submandibular para sua localização original. Anexe um tubo de microcentrífuga pré-marcado, revestido com anticoagulante, na extremidade distal da cânula.

Depois, reposicione todas as camadas musculares para suas posições originais e feche a incisão cutânea com pontos e/ou adesivo de tecido. Colete linfa continuamente em tubos microcentrífugas revestidos com anticoagulantes, substituindo os tubos em intervalos pré-determinados, tipicamente a cada hora. Garanta que o rato permaneça anestesiado durante todo o período de coleta.

Armazene as amostras coletadas com bolsas de gelo em uma caixa térmica. As taxas de fluxo linfático por hora medidas durante um período de coleta de seis horas em ratos canulados com sucesso variaram de 0,09 a 0,13 mililitros por hora. Em ratos saudáveis, o transporte linfático cumulativo da albumina marcada com trítio administrada intrastriatamente permaneceu negligenciável durante as duas primeiras horas e aumentou substancialmente depois.

A comparação das concentrações de albumina marcada com trítio entre linfa e plasma demonstrou diferentes perfis de concentração ao longo do tempo em ratos saudáveis. A neuroinflamação induzida pela administração interperitoneal de lipopolissacarídeo de Escherichia coli esteve associada a uma leve redução na taxa geral de fluxo linfático ao longo de oito horas e a quase duas vezes a redução na proporção da dose total transportada para a linfa. A razão de concentração linfático-plasma não mostrou diferença significativa entre ratos saudáveis e neuroinflamados, indicando perfis semelhantes de claridade linfática cervical.

Esse protocolo permitiu amostragem biológica direta de linfa derivada do cérebro, fazendo a ponte entre imagens externas indiretas ou métodos resinosos com a saída mensurável do sistema nervoso central. O protocolo permite estudar a eliminação de medicamentos administrada centralmente através de vias linfáticas, possibilitando a medição das rotas de drenagem e das taxas de eliminação. Estudos futuros podem examinar como estados de doença do SNC alertam para a depuração linfática e usar esse conhecimento para otimizar medicamentos que restaurem a função linfática cerebral para o tratamento.