Mapeamento da Imunidade Infantil com Entrada Mínima: Perfil Integrativo de Célula Única e Multiômico
3 de abril de 2026
Este protocolo descreve a coleta e preservação de amostras de sangue de pacientes neonatais e pediátricos e a aplicação de scRNA-seq, proteômica e citometria de fluxo espectral para caracterizar as populações de células imunes dessas amostras.
Nossa pesquisa define como a imunidade na primeira infância se adapta após o nascimento usando perfilamento multiômico longitudinal de alta dimensão a partir de pequenos volumes sanguíneos. Esse protocolo pode ser aplicado a estudos neonatais e pediátricos para perfilamento imunológico longitudinal a partir de bioamostras limitadas em saúde, infecção e inflamação. Para começar, descongele rapidamente um frasco contendo glóbulos vermelhos de bebê lisados em um banho-maria a 37 graus Celsius.
Transfira as células descongeladas para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio RPMI completo e quente a 37 graus Celsius. Centrifuge o tubo a 400 g por cinco minutos em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em três mililitros de meio RPMI completo e conte o número total de células.
Dilua a amostra se a concentração for alta demais para ser contada. Após contar as células, repita a etapa de centrifugação e re-suspenda as células em meio RPMI completo para obter uma concentração de um milhão de células por mililitro. Transfira 100 microlitros contendo 0,1 milhão de células para cada poço de uma placa de fundo em V de 96 poços.
Centrifuge a placa a 764 g por dois minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernadante. Em seguida, adicione 100 microlitros de corante vivo diluído de um a 2.000 em PBS com bloco FC e bloco de monócitos diluídos de um a 100 em todas as amostras, exceto o controle não corado.
Incube as amostras por 15 minutos a quatro graus Celsius. Para lavar as células, adicione 100 microlitros de PBS. Centrifuge a placa a 764 g por dois minutos a quatro graus Celsius e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
Adicione 100 microlitros de coquetel de anticorpos de superfície, diluído de um a 200 em filtragem celular ativada por fluorescência, ou FACS buffer, a todas as amostras, exceto ao controle não corado. Incube por 30 minutos a quatro graus Celsius. Depois, lave as células com 100 microlitros de tampão FACS, centrifuge e descarte o sobrenadante.
Fixe as células adicionando 100 microlitros de paraformaldeído a 4% a cada amostra. Incube por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro, depois lave as células novamente e ressuspenda em 200 microlitros de tampão FACS. Prepare as contas de compensação UltraComp como controles de cor única.
Tinga as esferas de controle de cor única usando o mesmo procedimento das amostras, incluindo fixação caso as amostras fossem fixas. Além disso, prepare a fluorescência sem um ou controles FMO da mesma forma. Execute as amostras, controles de cor única, controles sem coração e controles fluorescentes menos um em um citômetro de fluxo convencional ou espectral.
Abra o FlowJo e selecione a amostra de interesse para analisar. Defina portas usando controles apropriados de isotipo e FMO. Leucócitos de porta usando FSC versus SSC para excluir detritos e selecione células por tamanho e granularidade.
Exclua doublets usando FSCA versus FSCH. Controle células vivas usando um corante de viabilidade para excluir células mortas. A partir de células vivas isoladas, divide-se em linfócitos CD33-negativos e células mieloides CD33-positivas.
Dentro das células CD33-positivas, identifique monócitos CD14-positivos. Em seguida, dentro das células CD33-positivas, identifique células dendríticas CD14-negativas e CD11C-positivas. Agora, entre linfócitos CD33-negativos para a marcha das células T CD3-positivas e células CD3-negativas CD56-positivas para CD56.
Dentro das células T CD3-positivas, identifique subconjuntos CD8-positivos e CD4-positivos e identifique células B CD3-negativas, CD56-negativas e CD19-positivas. Para começar, descongele um frasco de células lisadas por glóbulos vermelhos preservados criogenialmente em um banho-maria a 37 graus Celsius. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de células T e centrifuge a 430 g por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernadante. Após ressuspender o pellet celular com um mililitro de PBS, adicione mais nove mililitros de PBS à amostra. Centrifuge o tubo a 430 g por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante.
Conte as células e avalie a viabilidade usando exclusão de azul de tripano. Se a viabilidade for inferior a 70%, utilize um kit de remoção de células mortas conforme segue. Primeiro, prepare um tampão de ligação 1x diluindo a solução de caldo tampão de 20x com água estéril destilada duplamente.
Resuspenda o pellet celular em 100 microlitros de microesferas de remoção de células mortas por 10 para a potência total de sete células. Misture bem e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Coloque a coluna de separação magnética no suporte magnético apropriado, junto com um tubo coletor.
Depois, equilibre a coluna enxaguando com 500 microlitros de tampão de ligação 1x. Leve o volume da suspensão da célula para 500 microlitros com um buffer de ligação 1x. Após substituir o tubo coletor, aplique a suspensão da célula à coluna e colete o fluxo no novo tubo microcentrífuga de 1,7 mililitros.
Em seguida, lave a coluna duas vezes com 500 microlitros de tampão de ligação e colete o fluxo no mesmo tubo da microcentrífuga. Centrifuge o eluado a 300 g por 10 minutos e descarte o sobrenadante. Conte as células e avalie novamente a viabilidade usando a exclusão do azul de tripano.
Aliquota 20.000 células viáveis em um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Depois, centrifuge as células a 300 g por 10 minutos e remova o sobrenadante. Re-suspenda as células com 40 microlitros de PBS contendo 0,04% de BSA.
Por fim, coloque o tubo contendo as células no gelo e envie-o imediatamente para uma instalação de núcleo genômico para geração e sequenciamento de bibliotecas. Colete os resultados do sequenciamento no formato de saídas do cell ranger. Amostras de sangue seco de bebês prematuros e controles foram processadas.
E a expressão normalizada de proteínas de 92 proteínas relacionadas ao sistema imunológico foi quantificada. A expressão do gene três de ativação de linfócitos e do adaptador transmembrana regulador do limiar de sinalização 1 foram significativamente mais altas no sangue periférico de bebês prematuros aos dois meses de idade em comparação com sangue do cordão a termo. Uma estratégia abrangente de portamento foi usada para identificar populações de leucócitos a partir de amostras de glóbulos brancos lisados por glóbulos vermelhos.
Dentro da população de células T, foram distinguidos subconjuntos CD4-positivos e CD8-positivos. Após a filtragem, mais de 120.000 células foram capturadas e perfiladas no conjunto de dados de sequenciamento de ácido ribonucleico de célula única. A redução de dimensionalidade e a análise de agrupamento identificaram 14 agrupamentos celulares distintos.
Os agrupamentos celulares foram anotados com base em genes expressos diferencialmente e marcadores celulares conhecidos. 12 dos 14 aglomerados correspondiam a linhagens celulares imunes, incluindo células T, células natural killer, células B, células mieloides e neutrófilos. Um gráfico de barras empilhadas ilustrou a proporção relativa de células por agrupamento em uma semana, um mês e dois meses de idade.
Este estudo permite a medição longitudinal de assinaturas imunes celulares, transcriptômicas, proteômicas e funcionais a partir de amostras de sangue de volume limitado. Estudos futuros podem utilizar esses métodos para definir trajetórias imunes saudáveis e descobrir respostas imunes desreguladas na infância ligadas a doenças.
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Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos otimizados para perfilamento imunológico de alta dimensão em neonatos utilizando volumes mínimos de sangue. Ao integrar técnicas avançadas como citometria de fluxo, proteômica e sequenciamento de RNA em única célula, o estudo permite uma análise longitudinal abrangente do desenvolvimento imunológico neonatal, mesmo em recém-nascidos com peso extremamente baixo ao nascer ou prematuros.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Pesquisa neonatal e pediátrica
- Análise de célula única
Antecedentes
- O sistema imunológico neonatal se adapta rapidamente a um novo ambiente rico em estímulos após o nascimento.
- A imunidade na primeira infância é exclusivamente adaptada às necessidades do desenvolvimento, não sendo meramente imatura.
- O estudo da imunidade neonatal é desafiador devido ao volume sanguíneo limitado disponível para pesquisa.
- O perfilhamento imunológico abrangente exige métodos que maximizem os dados obtidos a partir de pequenas amostras.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver e demonstrar protocolos para perfis imunes de alta dimensão a partir de pequenas amostras de sangue neonatal.
- Permitir estudos longitudinais do desenvolvimento imunológico em neonatos e bebês prematuros.
- Capturar assinaturas imunes celulares, transcriptômicas e proteômicas ao longo do tempo.
Métodos Utilizados
- Descongelação e processamento de amostras de hemácias lisadas de neonatos.
- Citometria de fluxo com estratégias detalhadas de seleção para identificar populações de células imunes (linfócitos T, linfócitos B, células NK, células mieloides, células dendríticas, monócitos, neutrófilos).
- Análise proteômica de amostras de gotas de sangue seco quantificando 92 proteínas relacionadas ao sistema imunológico.
- Sequenciamento de RNA de única célula com remoção de células mortas, preparação de biblioteca e análise de agrupamento de mais de 120.000 células.
- Coleta longitudinal em múltiplos pontos temporais (uma semana, um mês, dois meses).
Resultados Principais
- Os protocolos permitiram o perfil imunológico a partir de volumes sanguíneos muito pequenos, adequados para neonatos e bebês prematuros.
- Expressão significativamente mais elevada do gene de ativação de linfócitos três e do adaptador transmembranar regulador do limiar de sinalização 1 em bebês prematuros aos dois meses, em comparação com o sangue do cordão de nascidos a termo.
- Identificação e anotação de 14 agrupamentos celulares distintos, sendo 12 correspondentes a linhagens imunes conhecidas.
- Visualização das mudanças dinâmicas nas proporções de células imunes ao longo dos estágios iniciais da vida.
Conclusões
- Os métodos descritos permitem um perfil imunológico abrangente e longitudinal a partir de amostras limitadas de sangue neonatal.
- Essas abordagens facilitam o estudo do desenvolvimento imunológico saudável e a identificação de respostas desreguladas associadas a doenças.
- Os protocolos são amplamente aplicáveis à pesquisa imunológica neonatal e pediátrica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O perfilhamento integrado de única célula e multiômico a partir de volumes mínimos de sangue neonatal permite uma compreensão sem precedentes do desenvolvimento imunológico na primeira infância, superando limitações críticas de amostras na pesquisa pediátrica. Esta abordagem possibilita o mapeamento de alta resolução das trajetórias imunes, auxiliando na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas nos estágios iniciais da imunidade humana. Os protocolos facilitam o monitoramento imunológico longitudinal e quantitativo, impactando diretamente as decisões relativas ao pipeline translacional de programas terapêuticos pediátricos e neonatais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação direta de populações e vias de células imunes em neonatos utilizando mínimas amostras biológicas.
- Apóia a validação funcional de alvos ao capturar assinaturas transcriptômicas e proteômicas ao longo de pontos temporais do desenvolvimento.
- Oferece desvio mecanicista de riscos em programas de imunologia pediátrica ao revelar adaptações imunológicas únicas da primeira infância.
- Facilita a confiança preditiva na seleção de alvos para indicações neonatais e pediátricas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece fluxos de trabalho validados e reprodutíveis para identificação e quantificação de células imunes a partir de amostras de baixo volume.
- Padroniza estratégias de seleção e controles para citometria de fluxo, garantindo confiabilidade e comparabilidade do ensaio.
- Permite triagem escalonável e de alta dimensionalidade de fenótipos imunes e perfis de expressão proteica.
- Prepara sistemas biológicos robustos para avaliação de compostos subsequentes e descoberta de biomarcadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os resultados do perfil imunológico com modelos pediátricos e neonatais relevantes para doenças.
- Apoia a descoberta e validação longitudinal de biomarcadores para a desregulação imunológica na primeira infância.
- Garante continuidade do estágio de descoberta até a validação pré-clínica, permitindo amostragens e análises repetidas.
- Reduz os riscos do avanço translacional ao mapear as trajetórias imunológicas saudáveis e desreguladas em lactentes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de perfilamento integrativo conecta a descoberta inicial, triagem e pesquisa translacional ao permitir uma análise imune abrangente a partir de amostras neonatais limitadas.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a clarificação de vias no contexto da imunidade na primeira infância.
- Triagem: Fornece medições quantitativas e reprodutíveis de células imunes e proteínas, adequadas para fluxos de trabalho de alto rendimento.
- Análises: Oferece leituras multiômicas e saídas estatísticas para comparação robusta de estados de desenvolvimento e doenças.
- Pesquisa Translacional: Apoia o alinhamento de biomarcadores e a progressão ajustada ao risco em programas pediátricos e neonatais.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e escalável para perfilagem imunológica em diversas iniciativas de pesquisa pediátrica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa imunológica pediátrica.
- Valor Operacional: Permite o perfil imunológico padronizado, reproduzível e escalonável a partir de quantidade mínima de amostra.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao fornecer dados de alto conteúdo a partir de amostras limitadas.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos terapêuticos pediátricos e neonatais.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em citometria de fluxo, sequenciamento de RNA em nível de célula única e análise de dados de proteômica.
- Exige acesso a instrumentação avançada e infraestrutura de bioinformática para integração multiômica.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes no manuseio de amostras, estratégias de seleção de populações celulares (gating) e controles.
- Adaptável a diversos modelos pediátricos e neonatais mediante otimização do protocolo.
- Limitado pela necessidade de reagentes especializados e apoio de instalações centrais para sequenciamento e proteômica.
