Um modelo de lesão por hipóxia-reoxigenação em cardióides humanos auto-montantes

Nossa pesquisa foca em encontrar novas formas de ajudar o coração a se regenerar após uma lesão. Para isso, geramos organoides cardíacos auto-montantes e realizamos estudos de hipóxia-reoxigenação. Esse protocolo pode ser aplicado para estudar a resposta a lesões, intervenções terapêuticas para promover a regeneração e pode ser usado para modelagem específica de doença para paciente.

Para começar, aspire o meio de especificação do mesoderma cardíaco D1 e adicione solução de descolamento celular suficiente para cobrir totalmente as células do mesoderme cardíaco derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo humano. Depois, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. Usando uma pipeta, adicione um volume igual de meio mesodermático cardíaco D2 em cada poço e pipete suavemente para cima e para baixo para liberar as células aderentes, transferindo a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros.

Usando uma centrífuga, faça pellets nas células a 300G por três minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet em um mililitro de meio de especificação de mesoderma cardíaco D2 contendo cinco micromolares IWP-2 e 50 microgramas por mililitro de ácido ascórbico em RB menos. Misture 10 microlitros de azul de tripano com 10 micrólitros da suspensão celular em um microtubo.

Conte as células usando o método de contagem preferido, depois dilua-as até uma concentração de 100.000 células por mililitro em meio de especificação cardíaca D2 suplementado com dois micromolares tiazovivina. Transfira a suspensão da célula para um reservatório de reagente de tamanho adequado. Depois, usando uma pipeta multicanal, dispense 100 microlitros em cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultra-baixa para alcançar uma concentração final de 10.000 células por poço.

Gire a placa a 500G por cinco minutos em temperatura ambiente para induzir a formação de organoides cardíacos humanos em cultura em suspensão. Observe a formação de um grande pellet celular bem circunscrito em cada poço. Se o pellet não estiver circunscrito, repita a centrifugação.

Após 24 horas, prepare 10 mililitros de meio D3 contendo cinco micromolares IWP-2 e 50 microgramas por mililitro de ácido ascórbico em RB menos por placa. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros de mídia D3 a cada poço sem remover nenhum material existente. No dia seguinte, remova 100 microlitros de meio D3 de cada poço.

Para minimizar o risco de aspiração, incline a placa em um ângulo de 45 graus e mantenha uma pipeta multicanal em um ângulo de 90 graus em relação à parede lateral da placa. Coloque a pipeta firmemente na parede do poço e aspire lentamente. Após remover o meio, substitua-o por 100 microlitros de meio D4 contendo cinco micromolares IWP-2 em RB menos.

Usando uma pipeta de 1.000 microlitros com a ponta cortada, transfira os organoides cardíacos humanos para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Deixe os organoides afundarem no fundo do tubo e remova suavemente o excesso de mídia. Adicione soro salino tamponado com fosfato para lavar os organoides uma vez.

Espere alguns segundos para eles afundarem e retire suavemente o excesso de PBS. Em seguida, adicione 4% de paraformaldeído para fixar os organoides e coloque o tubo em temperatura ambiente por 30 minutos para permitir a fixação. Em seguida, transfira o número desejado de organoides fixos para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros.

Remova a solução fixadora e lave os organoides com PBS contendo 0,1% Tween 20. Prepare a solução primária de anticorpos diluindo o anticorpo até a concentração desejada na solução de coloração. Usando uma pipeta, adicione de 50 a 100 microlitros da solução primária de anticorpos a cada tubo da microcentrífuga, garantindo que os organoides estejam totalmente cobertos.

Após a incubação e lavagens subsequentes, incube a amostra com anticorpo secundário diluído em solução de coloração por 24 horas a quatro graus Celsius sobre uma plataforma agitadora. Após a incubação, realize lavagens conforme descrito anteriormente. Em seguida, usando uma ponta de pipeta cortada, transfira os organoides para uma lâmina de vidro carregada positivamente.

Remova suavemente o excesso de PBS com Tween 20 e adicione algumas gotas de meio de montagem para cobrir os organoides. Coloque cuidadosamente uma capa sobre os organoides para achatá-los. Depois, prossiga para a realização de microscopia de fluorescência.

Após incubar os organoides fixos durante a noite em 30% de sacarose a quatro graus Celsius, transfira-os para um molde plástico e adicione uma pequena gota de composto de temperatura de corte ideal ao molde, apenas o suficiente para cobrir os organoides. Usando pinças finas ou uma ponta de pipeta, reposicione delicadamente os organoides no composto para que não fiquem aglomerados e afastados das bordas do molde. Posicione os organoides o mais próximo possível do fundo do molde para maximizar o número presente em uma única criosseção.

Coloque o molde em um resfriador de isopor contendo uma camada de gelo seco para congelar a camada inicial de composto ideal para o corte. Espere alguns minutos para o composto endurecer e depois mova o molde para a bancada. Adicione composto adicional para temperatura de corte ideal até que o molde esteja cheio.

Deixe a primeira camada derreter completamente antes de voltar o mofo ao gelo seco para congelar completamente. Uma vez congelados, armazene os moldes a menos 80 graus Celsius ou proceda à criosseção para obter seções de seis micrômetros. Usando uma pipeta, transfira cinco mililitros de meio para hipóxia por placa organoide cardíaca humana de 96 poços para um frasco de cultura celular.

Coloque o frasco dentro de uma câmara para hipóxia e lave a câmara com gás anóxico composto por 5% de dióxido de carbono e 95% de nitrogênio por três minutos. Coloque a câmara em uma incubadora a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes de iniciar a hipóxia. Usando uma pipeta multicanal, remova aproximadamente 150 microlitros de meio de todos os poços da placa organoide cardíaca humana.

Depois, usando uma pipeta de 200 microlitros, remova cuidadosamente o material restante de cada poço individual sem perturbar os organoides. Adicione 50 microlitros de mídia para hipóxia em cada poço. Coloque a placa organoide cardíaca humana na câmara da hipóxia.

E lave a câmara com gás anóxico composto por 5% de dióxido de carbono e 95% de nitrogênio por três minutos. Coloque a câmara de hipóxia em uma incubadora a 37 graus Celsius por seis horas. Para iniciar a reoxigenação, remova os organoides cardíacos humanos da câmara da hipóxia.

Usando uma pipeta multicanal, adicione 150 microlitros de RB+media pré-aquecida a cada poço. Por fim, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius e permita pelo menos três horas de reoxigenação antes de realizar ensaios a jusante. Após seis horas de hipóxia e 24 horas de reperfusão, a atividade extracelular lactato desidrogenase aumentou significativamente em organoides cardíacos humanos lesionados em comparação com controles não lesionados.

Os organoides cardíacos tratados com hipóxia apresentaram núcleos cardiomiócitos positivos para TUNEL, e a porcentagem de núcleos de cardiomiócitos positivos para TUNEL foi significativamente maior em organoides lesionados em comparação com controles não lesionados. Foi observado um aumento dependente do tempo na formação de cicatrizes com o aumento da duração da hipóxia antes da reoxigenação. Às 24 horas após a reperfusão, 69% dos organoides cardíacos humanos não lesionados estavam batendo, enquanto nenhum dos organoides lesionados batia.

Organoides cardíacos humanos não lesionados apresentaram transientes sincronizados de cálcio em cinco regiões de interesse, com picos ocorrendo ao mesmo tempo e com formas de onda semelhantes. Organoides cardíacos humanos lesionados não apresentaram contrações coordenadas e, em vez disso, apresentaram transitórios espontâneos irregulares de cálcio em regiões de interesse. Esse protocolo permite aos pesquisadores imitar o infarto do miocárdio em organoides cardíacos humanos derivados de iPSC.

O maior desafio técnico para garantir danos reprodutíveis é a remoção completa dos meios existentes. Nossos estudos futuros visam identificar fatores que possam promover a regeneração de tecidos em modelos organoides cardíacos humanos.