Amostragem de DNA Ambiental de Embarcações de Observação de Baleias para Monitoramento de Cetáceos

Esse protocolo oferece uma abordagem padronizada para a amostragem de eDNA de baleias durante cruzeiros de observação de baleias. Existem muitos métodos diferentes de amostragem de eDNA disponíveis. Isso dificulta a análise comparativa de dados.

Nosso protocolo foi otimizado para as condições ambientais e garante salvaguardas contra contaminação. Com o apoio de um laboratório de rádio de eDNA, esse protocolo pode ser realizado por não especialistas e cientistas cidadãos durante atividades de observação de baleias e ao redor do mundo. Para começar, prepare materiais de documentação de campo, incluindo as fichas de dados de campo e o protocolo laminado passo a passo para amostragem ambiental de DNA de cetáceos.

Coloque um marcador à prova d'água, dois filtros de eDNA por pegada fluke, um número suficiente de luvas e um recipiente dedicado para resíduos na caixa. Prepare um ou mais baldes rígidos adequados para o tipo de embarcação e configuração a bordo, um recipiente ambiental secundário de DNA e uma bomba de água peristáltica ou a vácuo portátil. Use luvas durante todo o manuseio de equipamentos e troque as luvas entre as tarefas.

Para esterilizar o equipamento, aplique uma solução de água sanitária doméstica diluída, espirrando uniformemente em todas as superfícies dos baldes, tampas, recipientes e tubos da bomba. Enxágue bem com água da torneira três vezes. Leve todos os materiais a bordo antes da chegada dos passageiros e armazene-os em uma área limpa designada.

Coordenar o tempo de amostragem e o posicionamento da embarcação com a tripulação da embarcação. Observe padrões de emergência na água para antecipar mergulhos com baleias. Colete 20 litros de água do mar da pegada flukeprint o mais rápido possível, garantindo um atraso no máximo de 10 minutos após o mergulho da baleia.

Obtenha amostras de várias regiões usando condições logísticas personalizadas apropriadas a cada local e tipo de embarcação. Se necessário, transporte a água coletada para uma estação de filtragem designada a bordo, evitando derramamentos. Registre a identidade da espécie, coordenadas do sistema de posicionamento geográfico, horário e identificação de réplicas de amostras na ficha técnica.

Troque as luvas antes da filtragem. Abra o saco do filtro e manuseie o filtro apenas perto da tomada. Insira a entrada no snorkel e conecte o tubo da bomba à saída.

Submerga o snorkel na amostra de água sem submergir a carcaça do filtro e ajuste a bomba para uma vazão rápida e constante. Filtre 10 litros continuamente enquanto monitora a estabilidade do fluxo. Em seguida, inverta o filtro e deixe a bomba funcionar por 30 a 60 segundos para remover água residual.

Personalize a configuração da bomba de filtragem de acordo com as condições do campo. Desligue a bomba e desconecte o tubo. Coloque o filtro no saco original e etiquete-o imediatamente.

Troque as luvas e prepare-se para fazer a filtragem na segunda réplica. Armazene os filtros ambientais de DNA autopreservantes em um recipiente seco e seguro, em um cômodo sombreado e em temperatura ambiente. Refrigere os filtros se a temperatura ambiente ultrapassar 20 graus Celsius e envie dentro de três meses.

Realize todos os procedimentos laboratoriais em salas dedicadas esterilizadas por ultravioleta com ventilação adequada. Depois de colocar luvas e roupas de proteção sem DNA, limpe bem as bancadas de trabalho. Usando pinças sem DNA, dobre a membrana do filtro em triângulos e transfira-a para um tubo de reação de dois mililitros com a ponta orientada para baixo.

Adicione um tampão de lise de 400 microlitros composto por 380 microlitros de tampão TES e 20 microlitros de proteinase K a cada tubo de reação. Vórtice brevemente e incuba a 56 graus Celsius por pelo menos três horas com agitação. Coloque o filtro em uma entrada plástica com fundo perfurado e centrifuge a 18, 626G por 10 minutos em temperatura ambiente para separar o tampão de lise do filtro.

Reagentes de extração de pipetas em placas de lavagem e placas de elução. Use placas de ligação múltiplas se o volume total de lisado exceder 300 microlitros. Vártice partículas magnéticas e adicionar 30 microlitros por poço na primeira placa de ligação.

Execute o programa preliminar de captação de DNA para duas placas de ligação e o subsequente programa de extração de DNA no robô. Para rodar todas as reações QPCR em triplicado, prepare a mistura master necessária em um espaço de trabalho dedicado e distribua-a entre os poços. Adicione três microlitros de extrato padrão de DNA alvo ou eDNA a cada poço.

Após selar a placa de PCR preparada, centrifuge-a a 3.500G por 10 segundos, e a placa no termociclador quantitativo de PCR em tempo real. Por fim, execute o ensaio sob condições otimizadas de ciclo. 247 amostras ambientais de DNA ou eDNA foram coletadas na Baía de Skjalbandi, Islândia, e nos Açores, envolvendo a coleta de até 10 litros de água do mar com dois filtros de eDNA autopreservantes por pegada fluke.

Entre os 44 filtros de eDNA analisados para eDNA de jubarte, 20 forneceram sinais de amplificação, enquanto 24 não apresentaram amplificação. Blanks de extração, controles de campo e controles quantitativos por PCR não mostraram amplificação detectável, indicando ausência de contaminação. Entre as reações positivas, nove filtros de eDNA forneceram pelo menos um valor limiar de ciclo abaixo do limite de detecção e foram classificados como detecções confiáveis.

Os 11 filtros EDNA restantes produziram valores de limiar de ciclo acima do limite de detecção indicando detecções plausíveis. O valor limiar médio do ciclo foi marginalmente menor nos filtros de eDNA dos Açores, em cerca de 34,7, em comparação com os filtros da Islândia, com um valor de aproximadamente 36,9. A diferença nos valores limiar do ciclo entre os filtros de eDNA dos Açores e da Islândia não foi estatisticamente significativa.

Esse protocolo pode ser usado em futuras campanhas de amostragem de eDNA em grande escala para investigar a biodiversidade marinha ou a genética das populações de baleias. Esse protocolo permite a detecção e monitoramento não invasivo de táxons de cetáceos e coocorrentes por meio de eDNA contido em marcas de tremato coletadas em embarcações de observação de baleias.