Name: Amostragem de DNA Ambiental de Embarcações de Observação de Baleias para Monitoramento de Cetáceos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-10T12:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a coletar DNA ambiental de cetáceos em embarcações de observação de baleias. Este protocolo padronizado permite monitoramento não invasivo da biodiversidade marinha por pesquisadores e cientistas cidadãos treinados.

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<table><tbody><tr><td>Filtros alternativos de eDNA: SterivexTM /Waterra</td><td>Merck Millipore/Waterra Pumps Limited</td><td>SVHVL10RC/NA</td><td>0,45 & micro; M tamanho de poros. Exigir buffers de preservação de eDNA &nbsp;</td></tr><tr><td>AW1, AW2, buffers AE</td><td>Qiagen&nbsp; &nbsp;</td><td>19081, 19072, 19077</td><td>Soluções tampão usadas para purificação de DNA durante a extração</td></tr><tr><td>Solução de água sanitária (1:10)</td><td>DM - Denk mit, Hygienereiniger</td><td>Personalizado</td><td>Descontaminação da superfície. Todas as etapas dos processos laboratoriais</td></tr><tr><td>Baldes</td><td>Lojas de barcos, equipamentos de pesca, Amazon</td><td></td><td>Rígido. Borracha ou plástico duro (&ge; 10 L). Uma ou mais, dependendo da configuração de amostragem e da logística a bordo</td></tr><tr><td>Reagente de limpeza, PCR & nbsp expresso;</td><td>ExoSAP-IT</td><td>75001.1.EA</td><td>Preparação de produtos PCR para sequenciamento Sanger</td></tr><tr><td>Caixa de resfriamento</td><td>Habitação</td><td></td><td>Recipiente rígido isolado ou saco de resfriamento</td></tr><tr><td>Luvas descartáveis, tamanhos Grande (L) e Médio (M), Sem pó</td><td>Kimberly-Clark</td><td>43431, 55090</td><td>Luvas descartáveis de nitrilo ou látex, caixa de 100 unidades. Quantidade necessária: 1 caixa a cada 10 - 15 viagens</td></tr><tr><td>Padrões de DNA (3 & mu; L)&nbsp;</td><td>NA</td><td>Personalizado</td><td>Diluição serial derivada de tecido de DNA (8 pontos, 10 ng/& micro; L) de baleia-jubarte. Calibração em qPCR</td></tr><tr><td>Roupas de laboratório seguras para DNA</td><td>Falano, PP-Geral</td><td>081-2900</td><td>Todas as etapas dos processos laboratoriais.</td></tr><tr><td>Contêiner de eDNA</td><td>Lojas de moradias ou ferragens</td><td>NA</td><td>Tampo, durável, transparente (&ge; 10 L).&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de elução, tampa da vareta, placas de lavagem, placa de ligação</td><td>Qiagen</td><td>19581, 997004, 1031656, 302570</td><td>Plásticos usados para extração de DNA &nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol (8:10)</td><td>Aguente, o ISO do ACS soou</td><td>Vários</td><td>Esterilização no banco. Todas as etapas do laboratório</td></tr><tr><td>Fichas de dados de campo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de alta sensibilidade baseado em fluorescência</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>Ensaio de Alta Sensibilidade de Qubit dsDNA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA)</td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade (24.000 rpm)</td><td>Hettich Zentrifugen&nbsp;</td><td></td><td>Separa o sobrenadante contendo DNA dos detritos. Lise de DNA</td></tr><tr><td>Bolsas de gelo</td><td>Lojas de abrigo</td><td></td><td>Resfriamento das amostras dentro de contêineres de transporte</td></tr><tr><td>Espoletas IPC diretas e reversas</td><td>Tecnologias Integradas de DNA</td><td>NA</td><td>Produto personalizado usado para amplificação do DNA da espécie-alvo</td></tr><tr><td>Sondas qPCR IPC PrimeTime</td><td>Tecnologias Integradas de DNA</td><td>NA</td><td>Produto personalizado usado para amplificação do DNA da espécie-alvo</td></tr><tr><td>Exaustor de fluxo laminar &nbsp;</td><td>Produtos do Laboratório Kendro</td><td>VFS1206</td><td>Ambiente estéril para preparações de reagentes na preparação qPCR</td></tr><tr><td>Protocolo de campo ilustrado laminado &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Personalizado</td></tr><tr><td>Buffer de lise</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Buffer de lise DNeasy AL. Alternativa ao TES Buffer + Proteinase K</td></tr><tr><td>Conta magnética e traço; Robô de DNA baseado</td><td>Cabeça PCR KingFisher Apex 96</td><td>5400910</td><td>Software: BindIx PC&nbsp;</td></tr><tr><td>Partículas magnéticas para ligação a ácidos nucleicos (30 & micro; L)</td><td>Qiagen</td><td>67563</td><td>Partículas MagAttrait. Facilita a ligação do DNA a esferas magnéticas na extração de DNA</td></tr><tr><td>Master mix (5 & mu; L)</td><td>EMM, Tecnologias de Vida</td><td>4396838</td><td>TaqMan Environmental Master Mix (2.0)</td></tr><tr><td>Centrífuga Mini Giradora de Placas &nbsp;</td><td>Labnet</td><td>C1000</td><td>Filtrar gotículas líquidas e condensação de PCR e microplacas</td></tr><tr><td>Kit de Remoção de Inibidores de PCR OneStep-96</td><td>Pesquisa ZYMO</td><td>D6035</td><td>Purificação e remoção de contaminantes em extratos de eDNA &nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td>Poço Hard-Shell 96</td></tr><tr><td>Pipetas + pontas estéreis filtradas</td><td>Pipettes: BIOHIT, Dicas de filtro: Biozym Safe&nbsp; Dicas para Selar &nbsp; Profissional</td><td>Vários</td><td>Pipetas manuais ou eletrônicas podem ser usadas em vários volumes máximos</td></tr><tr><td>Centrífuga de Centrifugação de Placas &nbsp;</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Remove bolhas antes do qPCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Avantor VWR</td><td>A4392.0010</td><td>Digere proteínas para ajudar a liberar DNA durante a lise</td></tr><tr><td>Água purificada</td><td>MilliQ</td><td>NA</td><td>Água livre de RNase, usada para controles negativos e solução de limpeza &nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de reação (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td>Lise de DNA</td></tr><tr><td>Termocicladora quantitativa de PCR em tempo real</td><td>Analytikjena</td><td>NA</td><td>Plataforma QTower 3G. Amplifica e quantifica o DNA em tempo real</td></tr><tr><td>Cordas</td><td>Barcos, lojas de ferragens, portos de pesca</td><td>NA</td><td>Material resistente (por exemplo, polietileno ou corda trançada). Comprimento pelo menos duas vezes a altura da embarcação</td></tr><tr><td>Filme de vedação, adesivo, óptico</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Microselo 'B'. Selar a placa PRC antes da PCR</td></tr><tr><td>Filtros de eDNA autopreservantes</td><td>Smith-Root&nbsp;</td><td>11579-25</td><td>1.2 & micro; M tamanho de poros. Quantidade por campanha de amostragem: conforme necessário</td></tr><tr><td>Contêiner de transporte</td><td>Laboratórios, farmácias, Amazon</td><td>Vários</td><td>Isolamento de isopor</td></tr><tr><td>Software para alinhamento e análise de sequências biológicas</td><td>Bio Edit</td><td>Versão 7</td><td>Editor e Programa de Análise de Alinhamento de Sequências Biológicas Amigável para Windows 95/98/NT</td></tr><tr><td>Espremer garrafa</td><td>Laboratórios, farmácias</td><td>Vários</td><td>Recheado com água sanitária doméstica (1:10)</td></tr><tr><td>Software de análise estatística</td><td>Equipe do R Studio. (2023)</td><td>Versão 4.2.1</td><td></td></tr><tr><td>Luvas esterilizadas sem DNA</td><td>Sempercare&nbsp; edição</td><td>79712</td><td>Todas as etapas dos processos laboratoriais.</td></tr><tr><td>Buffer TES</td><td></td><td></td><td>Produto personalizado, equivalente ao buffer de lise DNeasy</td></tr><tr><td>Recipiente de resíduos tóxicos</td><td></td><td></td><td>Descarte seguro de resíduos perigosos. Todos os passos</td></tr><tr><td>Lâmpada UV &nbsp;</td><td>SterilAIR</td><td></td><td>Esterilização em exaustor para preparação de qPCR</td></tr><tr><td>Vortex-genie 2 misturador de vórtices &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50728002</td><td>Homogeneiza e mistura reagentes. Análise de DNA, extração</td></tr><tr><td>Contêiner de resíduos</td><td>Lojas de abrigo</td><td></td><td>Pequeno recipiente rígido</td></tr><tr><td>Bomba d'água (peristáltica/vácuo)</td><td>Eijkelkamp; Solinst/Smith-Root&nbsp;</td><td>12.34.SB; 410/12099</td><td>Bombas portáteis</td></tr><tr><td>Marcador à prova d'água</td><td>Vários</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amostragem de dna ambiental de embarcações de observação de baleias para monitoramento de cetáceos

Environmental DNA Sampling from Whale-Watching Vessels for Cetacean Monitoring

Amostragem de DNA Ambiental de Embarcações de Observação de Baleias para Monitoramento de Cetáceos

Environmental DNA (eDNA) offers a non-invasive approach for monitoring cetaceans, yet its widespread application from operational platforms requires ...

Esse protocolo oferece uma abordagem padronizada para a amostragem de eDNA de baleias durante cruzeiros de observação de baleias. Existem muitos métodos diferentes de amostragem de eDNA disponíveis. Isso dificulta a análise comparativa de dados.Nosso protocolo foi otimizado para as condições ambientais e garante salvaguardas contra contaminação. Com o apoio de um laboratório de rádio de eDNA, esse protocolo pode ser realizado por não especialistas e cientistas cidadãos durante atividades de observação de baleias e ao redor do mundo. Para começar, prepare materiais de documentação de campo, incluindo as fichas de dados de campo e o protocolo laminado passo a passo para amostragem ambiental de DNA de cetáceos.Coloque um marcador à prova d'água, dois filtros de eDNA por pegada fluke, um número suficiente de luvas e um recipiente dedicado para resíduos na caixa. Prepare um ou mais baldes rígidos adequados para o tipo de embarcação e configuração a bordo, um recipiente ambiental secundário de DNA e uma bomba de água peristáltica ou a vácuo portátil. Use luvas durante todo o manuseio de equipamentos e troque as luvas entre as tarefas.Para esterilizar o equipamento, aplique uma solução de água sanitária doméstica diluída, espirrando uniformemente em todas as superfícies dos baldes, tampas, recipientes e tubos da bomba. Enxágue bem com água da torneira três vezes. Leve todos os materiais a bordo antes da chegada dos passageiros e armazene-os em uma área limpa designada.Coordenar o tempo de amostragem e o posicionamento da embarcação com a tripulação da embarcação. Observe padrões de emergência na água para antecipar mergulhos com baleias. Colete 20 litros de água do mar da pegada flukeprint o mais rápido possível, garantindo um atraso no máximo de 10 minutos após o mergulho da baleia.Obtenha amostras de várias regiões usando condições logísticas personalizadas apropriadas a cada local e tipo de embarcação. Se necessário, transporte a água coletada para uma estação de filtragem designada a bordo, evitando derramamentos. Registre a identidade da espécie, coordenadas do sistema de posicionamento geográfico, horário e identificação de réplicas de amostras na ficha técnica.Troque as luvas antes da filtragem. Abra o saco do filtro e manuseie o filtro apenas perto da tomada. Insira a entrada no snorkel e conecte o tubo da bomba à saída.Submerga o snorkel na amostra de água sem submergir a carcaça do filtro e ajuste a bomba para uma vazão rápida e constante. Filtre 10 litros continuamente enquanto monitora a estabilidade do fluxo. Em seguida, inverta o filtro e deixe a bomba funcionar por 30 a 60 segundos para remover água residual.Personalize a configuração da bomba de filtragem de acordo com as condições do campo. Desligue a bomba e desconecte o tubo. Coloque o filtro no saco original e etiquete-o imediatamente.Troque as luvas e prepare-se para fazer a filtragem na segunda réplica. Armazene os filtros ambientais de DNA autopreservantes em um recipiente seco e seguro, em um cômodo sombreado e em temperatura ambiente. Refrigere os filtros se a temperatura ambiente ultrapassar 20 graus Celsius e envie dentro de três meses.Realize todos os procedimentos laboratoriais em salas dedicadas esterilizadas por ultravioleta com ventilação adequada. Depois de colocar luvas e roupas de proteção sem DNA, limpe bem as bancadas de trabalho. Usando pinças sem DNA, dobre a membrana do filtro em triângulos e transfira-a para um tubo de reação de dois mililitros com a ponta orientada para baixo.Adicione um tampão de lise de 400 microlitros composto por 380 microlitros de tampão TES e 20 microlitros de proteinase K a cada tubo de reação. Vórtice brevemente e incuba a 56 graus Celsius por pelo menos três horas com agitação. Coloque o filtro em uma entrada plástica com fundo perfurado e centrifuge a 18, 626G por 10 minutos em temperatura ambiente para separar o tampão de lise do filtro.Reagentes de extração de pipetas em placas de lavagem e placas de elução. Use placas de ligação múltiplas se o volume total de lisado exceder 300 microlitros. Vártice partículas magnéticas e adicionar 30 microlitros por poço na primeira placa de ligação.Execute o programa preliminar de captação de DNA para duas placas de ligação e o subsequente programa de extração de DNA no robô. Para rodar todas as reações QPCR em triplicado, prepare a mistura master necessária em um espaço de trabalho dedicado e distribua-a entre os poços. Adicione três microlitros de extrato padrão de DNA alvo ou eDNA a cada poço.Após selar a placa de PCR preparada, centrifuge-a a 3.500G por 10 segundos, e a placa no termociclador quantitativo de PCR em tempo real. Por fim, execute o ensaio sob condições otimizadas de ciclo. 247 amostras ambientais de DNA ou eDNA foram coletadas na Baía de Skjalbandi, Islândia, e nos Açores, envolvendo a coleta de até 10 litros de água do mar com dois filtros de eDNA autopreservantes por pegada fluke.Entre os 44 filtros de eDNA analisados para eDNA de jubarte, 20 forneceram sinais de amplificação, enquanto 24 não apresentaram amplificação. Blanks de extração, controles de campo e controles quantitativos por PCR não mostraram amplificação detectável, indicando ausência de contaminação. Entre as reações positivas, nove filtros de eDNA forneceram pelo menos um valor limiar de ciclo abaixo do limite de detecção e foram classificados como detecções confiáveis.Os 11 filtros EDNA restantes produziram valores de limiar de ciclo acima do limite de detecção indicando detecções plausíveis. O valor limiar médio do ciclo foi marginalmente menor nos filtros de eDNA dos Açores, em cerca de 34,7, em comparação com os filtros da Islândia, com um valor de aproximadamente 36,9. A diferença nos valores limiar do ciclo entre os filtros de eDNA dos Açores e da Islândia não foi estatisticamente significativa.Esse protocolo pode ser usado em futuras campanhas de amostragem de eDNA em grande escala para investigar a biodiversidade marinha ou a genética das populações de baleias. Esse protocolo permite a detecção e monitoramento não invasivo de táxons de cetáceos e coocorrentes por meio de eDNA contido em marcas de tremato coletadas em embarcações de observação de baleias.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo documenta métodos de coleta de amostras de água costeiros marinhos e processá-los para várias aplicações a jusante, incluindo concentração de biomassa, a purificação de ácido nucléico, a abundância de células, nutrientes e gases traço.

A amostragem da água do mar e Cobrança

Nós apresentamos um método de amostragem não invasiva para coletar amostras de cabelo de forma eficiente a partir elusive pequenos mamíferos, como mostrado para o pika americano. Demonstramos a utilidade deste método por extração de DNA de amostras de cabelo e ampliando vários tipos de marcadores moleculares usados ​​em estudos de ecologia da vida selvagem e conservação.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Descrevemos um protocolo para filtração de amostras de água com um cartucho de filtro e extração de DNA ambiental (eDNA) sem ter que abrir a caixa para remover o filtro. Este protocolo é desenvolvido para metabarcoding eDNA de peixes, mas também é aplicável a eDNA de outros organismos.

O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

O protocolo seguinte descreve a metodologia para: amostragem microplásticos à superfície do mar, a separação de identificação microplástico e química das partículas. Este protocolo está em linha com as recomendações para monitorização microplásticos publicados pelo MSFD Subgrupo Técnico sobre lixo marinho.

Protocolo para Microplásticos Amostragem na superfície do mar e análise de amostras

A maioria das pesquisas de microplástico até à data ocorreu em sistemas marinhos onde níveis de sólidos suspensos são relativamente baixos. Foco agora está mudando para sistemas de água doce, que podem caracterizar cargas de alta de sedimentos e detritos flutuantes. Este protocolo aborda coletando e analisando amostras de microplástico de ambientes aquáticos que contêm altas cargas de sólidos suspensas.

Amostragem, classificação e caracterização Microplastics em ambientes aquáticos com cargas de sedimentos suspensos altos e grandes destroços flutuantes

Os ensaios de DNA ambiental requerem um design rigoroso, testes, otimização e validação antes que a coleta de dados de campo possa começar. Aqui, apresentamos um protocolo para levar os usuários através de cada etapa de projeto de um ensaio qPCR específico da espécie, baseado em sonda para a detecção e quantificação de dna de uma espécie-alvo a partir de amostras ambientais.

Desenvolvimento e teste de ensaios quantitativos de PCR específicos para aplicações de DNA ambiental

Aqui, apresentamos um protocolo simples para amostragem genética não invasiva de populações de borboletas com base na coleta de campo de detritos residuais de ovos. Pode ser usado para confirmar a identidade da espécie e quantificar a variação genética. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a grupos mais amplos para o envolvimento da ciência comunitária.

Destacamento de Cientistas Comunitários para Realizar Amostragem Genética Não Destrutiva de Populações de Borboletas Raras

Aqui, apresentamos um novo protocolo para recuperar o eDNA marinho por meio da coleta e filtragem de amostras de água do mar de balsas em operação e outras embarcações comerciais.

O Laboratório Flutuante: Procedimento Operacional Padrão para Coleta e Filtragem de Amostras de Água do Mar de Balsas em Operação para Análise de DNA Ambiental

O protocolo detecta os principais genes do ciclo de metano nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas e visualiza sua distribuição espacial para melhorar a compreensão da regulação do metano e seus impactos ambientais nesses ecossistemas dinâmicos.

Visualizando a dinâmica microbiana do ciclo de metano em zonas úmidas costeiras

Aqui, descrevemos métodos de amostragem das zonas eufóticas de ecossistemas marinhos e de água doce para isolar cianofagos (e seus hospedeiros) e processos pós-amostragem que enriquecem genótipos únicos e caracterizam a dinâmica de interação vírus-hospedeiro.

Amostragem ambiental de micróbios fotossintéticos e seus vírus: do campo ao laboratório

Aprenda a coletar DNA ambiental de cetáceos em embarcações de observação de baleias. Este protocolo padronizado permite monitoramento não invasivo da biodiversidade marinha por pesquisadores e cientistas cidadãos treinados.

Amostragem de DNA Ambiental de Embarcações de Observação de Baleias para Monitoramento de Cetáceos

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