Name: Ensaio de Citometria de Fluxo Multiplex Baseado em Esferas para Perfil Funcional de Células T CAR (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda a realizar ensaio multiplex baseado em esferas para perfil funcional de células T CAR humanas usando citometria de fluxo. Este método permite detectar e quantificar múltiplas citocinas simultaneamente.

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<ol><li>Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+standardization+of+cytokine+profiling+in+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy.</a> Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).</li>
<li>Boulch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-talk+between+CAR+T+cell+subsets+and+the+tumor+microenvironment+is+essential+for+sustained+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity.</a> Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).</li>
<li>Teachey, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+predictive+biomarkers+for+cytokine+release+syndrome+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+targets%3A+a+versatile+cell%E2%80%91free+platform+to+characterize+CAR+T+cell+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro.</a> Front Immunol. 15, 1254162(2024).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co%E2%80%91culture+model+with+CAR%E2%80%91T+cells%2C+antigen%E2%80%91presenting+cells%2C+and+tumor+cells+to+evaluate+CAR%E2%80%91T+cell%E2%80%91induced+cytokine+release+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Bethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+fully+human+FOLR1-targeting+CAR+T+cells+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer.</a> Cells. 13 (22), 1880(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-125-800</td><td>Ensaio de citocina múltiplex baseado em bead para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>MACSPlex InspectoR Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Ferramenta baseada na web para gateway e análise automatizada de dados MACSPlex</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>Instrumento de citometria de fluxo de medição de dados múltiplex</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-803</td><td>Instrumento de citometria de fluxo de medição de dados múltiplex</td></tr><tr><td>MACSQuant Express Mode</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Software para gateway e análise automatizada</td></tr><tr><td>TexMACS Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-196</td><td>Meio de cultura celular livre de soro otimizado desenvolvido para o cultivo e expansão de células T humanas e de rato</td></tr></tbody></table>

ensaio de citometria de fluxo multiplex baseado em esferas para perfil funcional de células t car

Bead-Based Multiplex Flow Cytometry Assay for Functional Profiling of CAR T Cells

Ensaio de Citometria de Fluxo Multiplex Baseado em Esferas para Perfil Funcional de Células T CAR

Profiling CAR T cells presents challenges due to their heterogeneity, complex immune responses, and limited sample availability. Multiplex assays enable ...

Nossa pesquisa concentra-se na caracterização funcional de células T com receptor antigênico quimérico (CAR T) e desenvolveu um ensaio multiplex compatível com citometria de fluxo para análise da secreção de moléculas efetoras. Este procedimento pode ser aplicado à pesquisa com células CAR T para caracterização funcional, investigações mecanicistas, testes de controle de qualidade e avaliação de potência.Para começar, prepare culturas celulares de linfócitos T humanos geneticamente modificados com receptor de antígeno quimérico, ou células T CAR, juntamente com células-alvo que expressem ou não o antígeno correspondente, numa proporção efetora para célula-alvo de 2,5 para 1. Defina um ou múltiplos pontos temporais para a coleta do sobrenadante, com o objetivo de analisar citocinas secretadas ou monitorar a cinética das citocinas ao longo de um período definido.Reconstitua o padrão do analito adicionando 200 microlitros de tampão ou meio de cultura celular ao pellet e misture suavemente. Prepare seis tubos de reagentes e realize uma série de diluições de um para cinco do padrão reconstituído até 3,2 picogramas por mililitro ou 0,6 picogramas por mililitro. Prepare uma amostra em branco. Nas horas definidas após a co-cultura, centrifugue a co-cultura a 300 ×g durante cinco minutos a 21 graus Celsius. Utilize os sobrenadantes diretamente ou dilua-os para adequá-los à faixa da curva padrão.Umedeça previamente uma placa de filtro MACSPlex com 200 microlitros de tampão MACSPlex por poço e utilize um sistema de vácuo ou centrífuga para aspirar até que os poços estejam drenados. Agite a mistura de microesferas de captura em vórtex para ressuspender completamente as microesferas. Adicione 50 microlitros do padrão ou amostra e 20 microlitros das microesferas pré-diluídas aos poços de uma placa de filtro de 96 poços. Incube a placa por duas horas à temperatura ambiente com agitação a 450 rpm no escuro. Lave os poços duas vezes com 200 microlitros de tampão utilizando um sistema de vácuo. Adicione 100 microlitros do reagente de detecção 1 pré-diluído na proporção de 1 para 50 aos poços. Incube por uma hora à temperatura ambiente com agitação a 450 rpm, no escuro. Lave os poços duas vezes. Adicione 100 microlitros do reagente de detecção 2 pré-diluído na proporção de 1 para 50 aos poços. Incube por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação a 450 rpm no escuro. Lave os poços uma vez e ressuspender as amostras em 200 microlitros de tampão.Use o código de barras 2D no frasco das microesferas de captura para carregar as configurações de aquisição no citômetro de fluxo MACSQuant. Após fazer login no software, selecione a placa de filtro MACSPlex como o suporte de amostras. Clique no botão Código de Barras na barra de ferramentas para ativar o leitor de código 2D. Apresente o frasco ao leitor com o código de barras voltado para a luz piscante, a uma distância de 0,5 a 2,5 centímetros. Na guia Autolabel, atribua as Microesferas de Captura como MPx células T citotóxicas humanas e células natural killer e selecione Sem marcação. Defina as posições dos grupos para as diluições seriadas do padrão de células T citotóxicas e células natural killer. Na guia Configurações, selecione o Modo Expresso. Defina o tipo como Análise e o modo como MACSPlex_Padrão. Em seguida, realize uma mistura suave. Atribua a amostra desconhecida de forma semelhante e defina suas posições. Opcionalmente, agrupe as amostras e insira identificadores e descrições das amostras. Na guia Configurações, selecione novamente o Modo Expresso. Defina o tipo como Análise e o modo como MACSPlex_Amostra. Na tabela do experimento, verifique se as definições do suporte estão corretas. Certifique-se de que os níveis de líquido nos poços da placa de filtro estão adequados e inicie a medição. Usando os canais de ficoeritrina ou PE, isotiocianato de fluoresceína ou FITC e alóficocianina ou APC, adquira os dados em um citômetro de fluxo equipado com lasers azul e vermelho. Confirme que os modelos de modo expresso estão sendo usados para o gateamento automatizado e análise de dados no citômetro de fluxo MACSQuant. Alternativamente, faça upload dos arquivos de dados FSC ou MQD na ferramenta baseada na web InspectoR para medição automatizada e quantitativa de citocinas e resultados prontos para exportação. Verifique a separação adequada das 12 populações diferentes de microesferas de captura no canal FITC versus PE. Aplique a curva padrão para calcular as concentrações de citocinas. Por fim, exporte e visualize os resultados.Utilizando codificação multiplex de microesferas, distintos grupos de microesferas representando analitos individuais foram claramente resolvidos no gráfico biaxial. Após co-cultivo com células-alvo tumorais, as células CAR T secretaram altos níveis de granzima B, interferon gama ou INF-gama, fator de necrose tumoral alfa ou TNF-alfa e fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos ou GM-CSF, indicando ativação potente e função efetora citotóxica. Os níveis de interleucina-2 ou IL-2 ultrapassaram o limite superior de detecção, compatível com sinalização proliferativa intensa. Citocinas associadas a respostas regulatórias ou de linfócitos T auxiliares alternativas, incluindo IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 e proteína quimiotática de monócitos 1 ou MCP-1, estavam presentes em níveis baixos ou quase indetectáveis. As células CAR T exibiram liberação rápida e robusta de citocinas após o reconhecimento de alvos positivos para antígeno, com forte upregulação de granzima B, IFN-gama, TNF-alfa, GM-CSF e IL-2 entre 8 e 24 horas, atingindo níveis máximos em 48 horas. Aumentos moderados em IL-6, IL-17A, IL-21 e perfurina também foram observados. IL-4, IL-10 e MCP-1 permaneceram baixos ou ligeiramente elevados. Co-cultivos com alvos negativos para antígeno mostraram indução mínima de citocinas em todos os analitos.Este protocolo permite a quantificação de citocinas, quimiocinas e mediadores citotóxicos que refletem a ativação e a função efetora de células CAR T. Os aspectos mais importantes neste protocolo são a duração da cocultura, a proporção de efetoras para alvo, a diluição da amostra e a manutenção de níveis quantificáveis de analitos. Após este procedimento, o perfilamento do sobrenadante pode ser combinado com análises por citometria de fluxo, fenotipagem de células CAR T ou ensaios de citotoxicidade.

bead-based-multiplex-flow-cytometry-assay-for-functional-profiling

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O método IP-FCM é apresentado, o que permite uma sensível, avaliação, robusto bioquímica de espécies nativas interações proteína-proteína, sem a necessidade de engenharia genética ou grandes amostras.

FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

Este vídeo demonstra um imunoensaio multiplex baseado em esferas para quantificar vários alvos de citocinas em uma amostra. Uma mistura de microesferas distintas conjugadas a anticorpos específicos de citocinas é usada para ligar as citocinas presentes na amostra. Os repórteres marcados com estreptavidina são imobilizados nas citocinas ligadas usando anticorpos de detecção biotinilados. A citometria de fluxo identifica as citocinas ligadas com base nos tamanhos únicos e nas intensidades de...

Um imunoensaio multiplex baseado em grânulos para quantificar vários alvos de citocinas

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Análise do filme lacrimal citocinas ajuda no estudo de várias doenças oculares. Grânulo baseado multiplex ensaios são simples e sensível e permitem o teste de alvos múltiplos em amostras com volumes pequenos. Aqui descrevemos um protocolo para lágrima filme cytokine perfis usando o um grânulo baseado multiplex do ensaio.

Grânulo baseado Multiplex ensaio para análise de perfis de citocinas lágrima

Este protocolo descreve a quantificação de alvos múltiplos de citocinas simultaneamente em sobrenadantes de cultura de tecidos coletados de rato estimulada splenocytes usando multiplex do grânulo imunoensaio baseado em plataforma e um citômetro de fluxo.

Multiplexar Cytokine perfilação de Mouse estimulada Splenocytes usando uma plataforma baseada em Cytometric Bead imunoensaio

O isolamento de células de implantes dissecados e sua caracterização por citometria de fluxo podem contribuir significativamente para o entendimento do padrão de resposta imune contra implantes. Este trabalho descreve um método preciso para o isolamento de células de implantes dissecados e sua coloração para análise por citometria de fluxo.

Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

Este relatório descreve um protocolo automatizado para ensaios de imunofluorescência multiplex (mIF) em um corador de lâmina automatizado. Ele demonstra a alta reprodutibilidade da proteômica espacial em autocorantes de tecido padrão de alto rendimento e imageadores de fluorescência de lâmina inteira, o que é ideal para ensaios mIF personalizados em um grande número de lâminas de tecido em pesquisa translacional.

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

Aqui, descrevemos um método para criar gotículas de emulsão dupla encapsulando uma célula T e uma célula-alvo cancerígena para examinar a morte celular no nível de uma única célula. Este método permite a quantificação dupla de moléculas citotóxicas e apoptose de células-alvo em uma grande população de células T.

Ensaio de citotoxicidade baseado em gotículas para avaliar células T receptoras de antígeno quimérico no nível de célula única

Tregs são potentes supressores do sistema imune. Há uma falta de marcadores de superfície única para defini-los, portanto, definições de Tregs são principalmente funcionais. Aqui nós descrevemos um...

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

A citometria de fluxo pode ser utilizado para avaliar o estado da cromatina nas células T. Este protocolo permite que os cientistas interpretar evidência de descondensação da cromatina durante a activação das células T demonstrou por um aumento na intensidade de fluorescência média (IFM) de anticorpos fluorescentes Histona H3...

A citometria de fluxo para avaliar o estado de cromatina em células T

Aprenda a realizar ensaio multiplex baseado em esferas para perfil funcional de células T CAR humanas usando citometria de fluxo. Este método permite detectar e quantificar múltiplas citocinas simultaneamente.

Ensaio de Citometria de Fluxo Multiplex Baseado em Esferas para Perfil Funcional de Células T CAR

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