Geração do modelo de camundongo de ativação imunológica materna gestacional precoce para avaliar a inflamação pré-natal no neurodesenvolvimento

Nosso laboratório estuda como a inflamação pré-natal altera a biologia da microglia, as células imunes do cérebro que contribuem para desfechos negativos no neurodesenvolvimento. Modelos existentes de MI focam na gestação intermediária. No entanto, apresentamos um protocolo gestacional precoce que, além disso, incorpora métricas de controle de qualidade para melhorar a sobrevivência e a consistência.

O modelo pode ser aplicado a qualquer tipo selvagem ou modelo genético de camundongos para explorar o impacto da inflamação ambiental no desenvolvimento cerebral. Para começar, instale duas fêmeas C57 BL6 de oito a dez semanas com machos reprodutores C57 BL6 no final da tarde ou à noite. Na manhã seguinte, avalie as fêmeas para tampões vaginais e continue verificando uma vez por dia até que ocorra o tampão.

Os plugs são temporários e podem cair até a tarde, se não forem verificados pela manhã. Após confirmar a implantação vaginal, pese a fêmea do camundongo e registre o peso para monitorar o status da gravidez, acompanhando o ganho de peso durante a gestação. Separe as fêmeas conectadas a gaiolas individuais e mantenha-as sob condições padrão de moradia com acesso ad libidum a comida e água.

Designe as fêmeas implantadas como dia embrionário 0,5 e registre a data do tampão vaginal para garantir o acompanhamento preciso da idade gestacional. Para reconstituir poli IC liofilizado em uma solução de stock de alta concentração, dissolva-o em soro fisiológico estéril ou água estéril, conforme as instruções do fabricante. Vortex, a solução de alto padrão de concentração.

Depois, dilua a solução em soro fisiológico para preparar um estoque de baixa concentração. Para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, aliquota aproximadamente 125 microlitros do estoque de baixa concentração em tubos de 1,5 mililitro e armazene os tubos a 20 graus Celsius ou 80 graus Celsius. Imediatamente antes da injeção, no dia embrionário 9,5.

Dilua o estoque de poli IC de baixa concentração com soro fisiológico estéril para obter uma concentração de trabalho. Aqueça o material de trabalho a 65 graus Celsius por 10 minutos para garantir a reanealização adequada da estrutura do ácido ribonucleico de fita dupla. Depois, faça vórtice ou pipete a solução para garantir uma mistura homogênea antes da injeção.

Para confirmar a gravidez, pese a barragem na manhã do dia embrionário 9,5. Calcule o volume de injeção de poli-IC para ativação imunológica materna, ou MIA, e o volume de injeção de 0,9% de soro para os controles. Extraia o volume apropriado da solução de trabalho poli-IC preparada ou soro fisiológico em uma seringa estéril de calibre 27 ou menor.

Agora, segure adequadamente a represa para minimizar a dor e o sofrimento. Injete o ácido poli-IC ou soro fisiológico intraperitonealmente no quadrante inferior esquerdo ou direito, logo acima do nível do quadril ou no segundo conjunto de mamilos. Depois, descarte as seringas em um recipiente BioSafety Sharps.

Além disso, registre o lado da injeção para manter a consistência entre as coortes. Devolva imediatamente a mãe à gaiola e monitore qualquer sinal de sofrimento. Depois, suplemente a gaiola com hidrogel por pelo menos 24 horas após a injeção para evitar a desidratação associada ao comportamento de doença.

Depois disso, registre o volume injetado da dose poli-IC, data e hora da injeção, idade gestacional e número do lote do poli-IC. Três horas após a injeção, observe cada camundongo individualmente por um minuto e avalie comportamentos como redução de atividade, postura curvada, caretas faciais ou fezes úmidas usando uma escala de três pontos. Classifique camundongos que apresentam um ou mais desses comportamentos como apresentando comportamentos de doença aguda.

Depois, usando um método minimamente invasivo, como sangramento caudal, colete cuidadosamente o sangue materno da represa injetada. Colete aproximadamente 50 microlitros de sangue. Após confirmar a hemostase, devolva a barragem à gaiola de casa.

Deixe o sangue coletado coagular por 30 minutos em temperatura ambiente. Centrifuge a amostra a 2000 G por cinco minutos em temperatura ambiente para separar o soro do coágulo. Após centrifugar a amostra novamente, colete cuidadosamente a camada superior clara do soro sem perturbar o coágulo.

Armazene o soro a 20 graus Celsius, até estar pronto para análise de citocinas a jusante. Após a injeção, pese as barragens diariamente por três dias para monitorar a resposta ao ácido poli-IC. No dia do parto esperado, registre os resultados da ninhada, incluindo tamanho da ninhada, viabilidade do filhote ou ausência de ninhada, para indicar uma gravidez malsucedida.

Remova prontamente quaisquer filhotes mortos e descarte-os conforme as diretrizes institucionais de biossegurança. Use ensaios ELISA ou multiplex para quantificar citocinas inflamatórias como IL-6 e TNF-alfa no soro materno após MIA ou injeções de controle seguindo as instruções do fabricante. Após a quantificação, use os resultados para estabelecer um limiar representativo para a resposta do MIA.

Por fim, realize uma análise estatística usando nosso software para avaliar a relação entre os níveis de IL-6 sérico materno e TNF alfa. Após a administração de poli IC no dia embrionário 9,5, as barragens MIA apresentaram níveis significativamente aumentados de IL-6 em relação às mães controle. Os níveis alfa de TNF mostraram forte correlação positiva com os níveis maternos de IL-6.

Entre o dia embrionário 0,5 e o dia embrionário 9,5, as mães que tiveram sucesso de nascerada ganharam significativamente mais peso do que as mães que não conseguiram produzir ninhada. Um dia após a injeção, as barragens desaparecidas perderam peso, enquanto as barragens de controle tratadas com soro fisiológico ganharam peso. Mas no décimo décimo dia embrionário, ambos os grupos apresentaram ganho de peso semelhante.

O peso pré-gestação não afetou a eficácia da ninhada nem em barragens controladas com soro salino nem em dãs desaparecidas. No entanto, camundongos C57 BL6 provenientes dos Jackson Labs tiveram ninhadas mais bem-sucedidas do que camundongos C57 BL6 provenientes de Charles River durante o procedimento MIA. Em contraste, a origem da poli IC não afetou a eficácia da ninhada.

Além disso, animais provenientes dos Laboratórios Jackson apresentaram uma resposta inflamatória materna mais robusta, medida pelo soro IL-6, em comparação com os animais provenientes do Charles River. Em contraste, a resposta inflamatória materna foi a mesma entre as diferentes fontes de poli IC. O protocolo permite a geração reprodutível do modelo inicial de MIA e correlação da gravidade da inflamação materna com os desfechos experimentais da prole. É fundamental manter registros detalhados, acompanhar os números de lotes de reagentes e avaliar as respostas maternas das citocinas em todas as barreiras para garantir resultados reprodutíveis.