Name: Produção Rápida de Ribonuclease Humana SLFN14 Recombinante e Análise Estequiométrica por Fotometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-20T14:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprenda a produzir rapidamente a ribonuclease humana SLFN14 recombinante em células HEK293 e analise sua estequiometria por fotometria de massa. Este método facilita estudos bioquímicos e estruturais.

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<ol><li>Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+ribosome-associated+endoribonuclease+slfn14+from+rabbit+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes.</a> Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).</li>
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<li>Seong, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schlafen+14+%28slfn14%29+is+a+novel+antiviral+factor+involved+in+the+control+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Schlafen 14 (slfn14) is a novel antiviral factor involved in the control of viral replication.</a> Immunobiology. 222 (11), 979-988 (2017).</li>
<li>Jo, U., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural%2C+molecular%2C+and+functional+insights+into+schlafen+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Structural, molecular, and functional insights into schlafen proteins.</a> Exp Mol Med. 54 (6), 730-738 (2022).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velcrin-induced+selective+cleavage+of+trna%28leu%29%28taa%29+by+slfn12+causes+cancer+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Velcrin-induced selective cleavage of trna(leu)(taa) by slfn12 causes cancer cell death.</a> Nat Chem Biol. 19 (3), 301-310 (2023).</li>
<li>Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schlafen+11+%28slfn11%29%2C+a+restriction+factor+for+replicative+stress+induced+by+DNA-targeting+anti-cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies.</a> Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schlafen+11+triggers+innate+immune+responses+through+its+ribonuclease+activity+upon+detection+of+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schlafen 11 triggers innate immune responses through its ribonuclease activity upon detection of single-stranded DNA.</a> Sci Immunol. 9 (96), eadj5465(2024).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon-usage-based+inhibition+of+hiv+protein+synthesis+by+human+schlafen+11%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Codon-usage-based inhibition of hiv protein synthesis by human schlafen 11.</a> Nature. 491 (7422), 125-128 (2012).</li>
<li>Valenzuela, C., Saucedo, S., Llano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schlafen14+impairs+hiv-1+expression+in+a+codon+usage-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Schlafen14 impairs hiv-1 expression in a codon usage-dependent manner.</a> Viruses. 16 (4), (2024).</li>
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<li>Van Riper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoem+structure+of+the+slfn14+endoribonuclease+reveals+insight+into+rna+binding+and+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryoem structure of the slfn14 endoribonuclease reveals insight into rna binding and cleavage.</a> Nat Commun. 16 (1), 5848(2025).</li>
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<li>Hutchinson, A., Seitova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+prmt+proteins+using+the+baculovirus+expression+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system.</a> J Vis Exp. (173), e62510(2021).</li>
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<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+hek293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension.</a> J Vis Exp. (106), e53568(2015).</li>
<li>Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+counting+and+viability+assessment+of+2d+and+3d+cell+cultures%3A+Expected+reliability+of+the+trypan+blue+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Cell counting and viability assessment of 2d and 3d cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay.</a> Biol Proced Online. 19, 8(2017).</li>
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<li>Glasel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+nucleic+acid+purities+monitored+by+260nm%2F280nm+absorbance+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios.</a> Biotechniques. 18 (1), 62-63 (1995).</li>
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<li>Swiech, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+of+serum-free+suspension+hek+293+cell+culture+for+efficient+production+of+human+rfviii%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient transfection of serum-free suspension hek 293 cell culture for efficient production of human rfviii.</a> BMC Biotechnol. 11, 114(2011).</li>
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<li>Liu, H., May, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+structures+of+igg+molecules%3A+Structural+variations%2C+chemical+modifications+and+possible+impacts+to+stability+and+biological+function%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond structures of igg molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function.</a> MAbs. 4 (1), 17-23 (2012).</li>
<li>Marenchino, M., Armbruster, D. W., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+purification+of+rna-binding+proteins%3A+Application+to+hiv-1+rev%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient purification of rna-binding proteins: Application to hiv-1 rev.</a> Protein Expr Purif. 63 (2), 112-119 (2009).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+proteoform+project%3A+Defining+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">The human proteoform project: Defining the human proteome.</a> Sci Adv. 7 (46), eabk0734(2021).</li>
<li>Carrasco-Zanini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+biological+influences+on+the+human+plasma+proteome+beyond+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Mapping biological influences on the human plasma proteome beyond the genome.</a> Nat Metab. 6 (10), 2010-2023 (2024).</li>
<li>Adhikari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-stringency+blueprint+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A high-stringency blueprint of the human proteome.</a> Nat Commun. 11 (1), 5301(2020).</li>
<li>Liao, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rbpworld+for+exploring+functions+and+disease+associations+of+rna-binding+proteins+across+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species.</a> Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).</li>
<li>Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rna-binding+proteins+in+human+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Rna-binding proteins in human genetic disease.</a> Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).</li>
<li>Poodts, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+expression+of+sars-cov-2+spike+rbd+using+the+insect+cell-baculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system.</a> Viruses. 14 (12), (2022).</li>
<li>Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+proteins+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells.</a> Methods. 147, 40-49 (2018).</li>
<li>Shi, X., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+n-glycosylation+in+the+baculovirus-insect+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system.</a> Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol (b-Me)</td><td>Sigma</td><td>M3148-500ML</td><td>14,3 M soluções tack</td></tr><tr><td>AcquireMP 2024 R2</td><td>Refeyn</td><td>/</td><td>Software de aquisição de dados</td></tr><tr><td>Adenosina-5'-trifosfato sal dissódico triidrato (ATP)</td><td>Chem-Impex International</td><td>00015-100G</td><td>ajustar a solução para pH 7,0</td></tr><tr><td>Gel de afinidade anti-Flag M2</td><td>Millipore</td><td>A2220</td><td>Resina de afinidade anti-bandeira</td></tr><tr><td>Hidrato de cloridrato de benzamidina</td><td>Sigma</td><td>B6506-25G</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Padrões de proteína de ampla faixa (10-250 kDa)</td><td>Bio-Rad</td><td>P7719S</td><td>Padrões de proteína prestained</td></tr><tr><td>Condessa 3</td><td>Invitrogen</td><td>A49862</td><td>contador automático de células</td></tr><tr><td>DiscoverMP v2024 R2</td><td>Refeyn</td><td>/</td><td>Software de análise de dados</td></tr><tr><td>Soro tampão fosfatado de Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Coronha solução 1x</td></tr><tr><td>Peptídeo DYKDDDK</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A36805</td><td>Peptídeo 3xFlag</td></tr><tr><td>Células FreeStyle 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>Células de suspensão de mamíferos</td></tr><tr><td>Nuclease Geniust M DMF arquivada</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-391121B</td><td>Nuclease universal</td></tr><tr><td>HyClone CDM4HEK293 mídia</td><td>Cytiva</td><td>SH3085802</td><td>Meio de crescimento sem soro</td></tr><tr><td>Mídia HyClone SFM4Transfx-293</td><td>Cytiva</td><td>SH3086002</td><td>Meio de transfecção transitório</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>Zeiss</td><td>4Y00-R0DY-1007-3BF3</td><td>Óleo de imersão</td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3032-02</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de amostras de Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td>Coronha de solução 2x</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>VWR</td><td>J580-25MG</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>MassFerence P1&nbsp;</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-41033</td><td>Coronha calibrante 500x</td></tr><tr><td>Kit de preparação de amostras UC da MassGlass</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-21022</td><td>Ferrolho e Junta</td></tr><tr><td>Coluna micro biospin</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td>Coluna vazia de spin de polipropileno</td></tr><tr><td>Sistema Milli-Q IQ 7000</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0C</td><td>Água ultrapura tipo I</td></tr><tr><td>Mini géis TGX Protean sem manchas</td><td>Bio-Rad</td><td>4568086</td><td>4-15% SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Minitron com umidade, resfriamento e CO2</td><td>Infors</td><td>72175</td><td>Shaker incubador</td></tr><tr><td>Kit de alinhamento MP</td><td>Refeyn</td><td>MP-CON-21019</td><td>ferramenta de alinhamento, pinça de ponta macia, ímã</td></tr><tr><td>Nanofotômetro</td><td>Implete</td><td>NP80</td><td>Espectrofotômetro UV-vis</td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Clay Adams Brand</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-45036B</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF)</td><td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>P20270-25.0</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Frasco de shake de policarbonato &nbsp;</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>WPFBC1000S</td><td>frasco de base ventilado e defletido</td></tr><tr><td>Polietilenemina (PEI) MW 40.000</td><td>Policiências</td><td>24765</td><td>reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Fluorômetro Qubit 4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de alta sensibilidade para RNA Qubit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P32852</td><td>quantificação usando corante específico de RNA</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6065</td><td>Coomassie G-250</td></tr><tr><td>DNA plasmídico de expressão de SLFN14</td><td>Orígenes</td><td>RC226257</td><td>clone ORF marcado por humanos</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Millipore</td><td>1.37017</td><td></td></tr><tr><td>Tris, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J60202. K2</td><td>Material de solução bufferizado de 1 M</td></tr><tr><td>Tris (2-carboxietil) cloridrato de fosfina (TCEP)</td><td>Biotecnologia do Ouro</td><td>TCEP10</td><td>TCEP</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>M143-1L</td><td>detergente</td></tr><tr><td>Coloração azul de Tripan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>0,4% ações de solução</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>VWR</td><td>0777-1L</td><td>detergente</td></tr><tr><td>TwoMP</td><td>Refeyn</td><td>MP-PRO-00001</td><td>Fotômetro de massa</td></tr><tr><td>Coluna Zeba 40K Desaltin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A57759</td><td>Cromatografia de exclusão de tamanho</td></tr></tbody></table>

produção rápida de ribonuclease humana slfn14 recombinante e análise estequiométrica por fotometria de massa

Rapid Production of Recombinant Human SLFN14 Ribonuclease and Stoichiometric Analysis by Mass Photometry

Produção Rápida de Ribonuclease Humana SLFN14 Recombinante e Análise Estequiométrica por Fotometria de Massa

Ribonucleases are a specialized class of RNA binding proteins that catalyze RNA cleavage and contribute to diverse biological processes including gene ...

rapid-production-recombinant-human-slfn14-ribonuclease-stoichiometric

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um novo método que envolve a análise quantitativa de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) sinais é descrito para o estudo de cinética enzimática.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

RNA celular total fornece um modelo pobre para estudar mudanças de curto prazo na síntese de RNA e decadência, bem como a cinética de processamento de RNA. Aqui, descrevemos a marcação metabólica de RNA recentemente transcrito com 4-tiouridina seguido por biotinilação específica do tiol e a purificação do ARN recém transcritos que permitam ultrapassar estas limitações.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

As exonucleases desempenham papéis críticos na garantia da estabilidade do genoma. A perda da função da exonuclease WRN resulta em envelhecimento prematuro. O estudo de substratos e outros requisitos da nuclease in vitro pode ajudar a elucidar seu papel in vivo. Aqui demonstramos um ensaio rápido e reprodutível baseado em fluorescência para medir sua atividade de nuclease.

Um ensaio de exonuclease baseado em fluorescência para caracterizar DmWRNexo, ortólogo da exonuclease WRN progeróide humana e sua aplicação a outras nucleases

Este protocolo descreve como realizar ensaios de quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas usando monitoramento de reação selecionado. Foi usado para quantificar com precisão as proteínas da via de sinalização da quimiotaxia de macrófagos de camundongos. A seleção de peptídeos alvo, o desenvolvimento do ensaio e os ensaios qualitativos e quantitativos são descritos em detalhes.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Nós descrevemos um método para gerar e amplificar geneticamente modificado vírus sincicial respiratórios (RSVs) e um ensaio de placa otimizado para RSVs. Ilustramos este protocolo criando dois vírus recombinantes que respectivamente permitem quantificação de replicação RSV e análise de corpos de inclusão RSV e grânulos associada a corpos de inclusão dinâmica de viver.

Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para um método de sequenciamento baseado em LC-MS que pode ser usado como um método direto para sequenciar RNA curto (&lt;35 nt por execução) sem um intermediário de cDNA e como um método geral para sequenciar diferentes modificações de nucleotídeos em um único estudo com precisão de base única.

2D-HELS MS Seq: Um método geral baseado em LC-MS para sequenciamento direto e de novo de misturas de RNA com diferentes modificações de nucleotídeos

Transferência de energia de fluorescência de molécula única é um método que rastreia a dinâmica do tRNA durante a síntese de proteína ribossômica. Ao rastrear ribossomos individuais, são identificadas populações inhomogêneas, que lançam luz sobre mecanismos. Este método pode ser usado para rastrear mudanças conformacionais biológicas em geral para revelar relações de função dinâmica em muitos outros biossistemas complexos. Métodos de molécula única podem observar etapas limitantes sem taxa e...

Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

Um protocolo detalhado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) usando tecnologias de misturador de jato de impacto confinado (CIJ), incluindo um CIJ de dois jatos e um misturador de vórtice de entrada múltipla de quatro jatos (μMIVM), é demonstrado. Os misturadores CIJ geram ambientes de micromistura turbulentos e reprodutíveis, resultando na produção de LNPs monodispersos.

Sintetizando Nanopartículas Lipídicas por Fluxo Turbulento em Misturadores de Jato de Impacto Confinado

Apresentamos um protocolo atualizado para a produção do sistema OnePot 'Síntese de proteínas usando elementos recombinantes' (PURE) e ribossomos brutos para síntese de proteínas livres de células, com foco no controle do crescimento celular para minimizar as variações de lote para lote.

Refinamento da produção de ribossomos OnePot PURE e brutos para síntese de proteínas livres de células reprodutíveis

Este protocolo descreve a produção e purificação recombinante da hidrofofina SC16 de Escherichia coli e fornece ensaios baseados em fluorescência para monitorar sua auto-montagem.

Produção e purificação recombinante da hidrofobina SC16 a partir de Escherichia coli e monitoramento de sua auto-montagem usando ensaios de fluorescência

Aprenda a produzir rapidamente a ribonuclease humana SLFN14 recombinante em células HEK293 e analise sua estequiometria por fotometria de massa. Este método facilita estudos bioquímicos e estruturais.

Produção Rápida de Ribonuclease Humana SLFN14 Recombinante e Análise Estequiométrica por Fotometria de Massa

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