Mapeamento da morfologia das células estreladas hepáticas em modelos camundongos de fibrose hepática

Este protocolo apresenta um pipeline abrangente de imagem para visualizar e modelar a morfologia das células estreladas hepáticas em tecido hepático intacto. A imagem 2D atual não apresenta a morfologia celular estelada completa, limitando os insights estruturais e funcionais. Esse protocolo permite capturas robustas de arquiteturas 3D complexas.

Para começar, belisque as palmas de um camundongo anestesiado para garantir a anestesia adequada. Borrife o abdômen com 70% de etanol para molhar o pelo. Com uma pinça, levante a pele no meio do abdômen alinhada com as patas traseiras e comece a cortar a pele para revelar o abdômen.

Depois, use cotonetes molhados com PBS para mover intestinos e outros órgãos para o lado e levantar o lobo esquerdo. Corte cuidadosamente a membrana presa entre o lobo esquerdo e o lobo caudado. Depois, use um ponto para amarrar na base superior do lobo esquerdo.

Corte o lobo esquerdo abaixo do nó de sutura e o deixe de lado para coleta e processamento da amostra de tecido. Use cotonetes molhados com PBS para mover o fígado e revelar a veia porta. Depois, insira cuidadosamente a agulha do cateter na veia porta aproximadamente na metade do comprimento.

Remova a agulha do cateter. Garanta um retorno de sangue pelo cateter para indicar a inserção bem-sucedida. Conecte o tubo preenchido da bomba de perfusão em funcionamento ao cateter e perfunda o fígado com 20 mililitros de PBS.

Clampe a artéria pulmonar acima do fígado com um hemostado para impedir que o PBS passe pelo coração. Corte a veia cava inferior para liberar o acúmulo de pressão. Ajuste a velocidade da bomba para cinco mililitros por minuto.

Após 15 minutos, pare a bomba para trocar o reservatório para 4% de paraformaldeído e depois perfunda o fígado com 25 mililitros de paraformaldeído a 4%. Após a perfusão estar concluída, remova o fígado dos órgãos ao redor cortando os tecidos conectados. Coloque o fígado em um tubo cônico de 50 mililitros cheio de 25 mililitros de paraformaldeído a 4%.

Coloque o tubo horizontalmente sobre uma plataforma de balanço durante a noite em um quarto frio a quatro graus Celsius a 1,5 rotação por minuto. No dia seguinte, lave o fígado três vezes em PBS em uma plataforma de balanço de banco por 30 minutos cada a temperatura ambiente a 1,5 rotação por minuto. Transfira o fígado para 20 mililitros de PBS com azida de sódio 0,02% e armazene a quatro graus Celsius.

Corte as amostras de fígado em pedaços de aproximadamente 0,5 a 1 centímetro cúbico de tamanho. Transfira as amostras de fígado para frascos de vidro com tampas roscas. Desidrate as amostras em uma série de metanol diluído em água de 20% a 80% em um rotador de roda a oito rotações por minuto durante uma hora em cada temperatura ambiente.

Após a limpeza da amostra, permeabilização, imunomarcação e limpeza, incube a amostra em éter dibenzílico durante a noite em temperatura ambiente antes da imagem. As amostras podem ser armazenadas no éter dibenzílico por até um ano sem perda do sinal de coloração. Para imagens confocais, coloque a amostra limpa em um recipiente de vidro de 35 milímetros com fundo de vidro e um fundo de vidro número 1,5.

Encha o recipiente com etílico e caninato para submergir completamente a amostra. Depois, coloque a placa no palco do microscópio confocal. Adquira uma imagem de tile no plano mais brilhante para capturar uma grande área da amostra usando o formato 1024 por 1024 e uma velocidade de 600.

Com base na imagem do tile, selecione regiões de interesse para coletar um Z-scan de maior resolução. Em seguida, adquira uma pilha Z que abrange toda a profundidade do tecido limpo na resolução mais alta suportada pelo microscópio, usando o formato 1024 por 1024 e velocidade de varredura de 600. Perfusão bem-sucedida e fixação do fígado do camundongo resultaram em uma cor uniforme de amarelo bege pálido.

Perfusão inadequada resultava em regiões de coágulos sanguíneos vermelho escuro ou marrom, o que reduzia a clareza óptica e levava a um sinal de fundo alto nessas regiões. A transparência óptica completa foi alcançada após a incubação no éter dibenzílico, onde o tecido parecia limpo em comparação com antes da limpeza. Os Z-stacks de alta resolução revelaram processos dendríticos finos que se estendem a partir do corpo celular de células estreladas hepáticas individuais.

Tanto amostras de fígado de controle quanto de tetracloreto de carbono crônico apresentaram sinais fluorescentes fortes e estáveis sob microscopia confocal. Esse pipeline mapeia reproduvelmente a morfologia das células estreladas no complexo servidor do microambiente, capturando processos dendríticos e relações espaciais com células vizinhas. O compromisso de tempo é uma consideração importante ao executar o protocolo.

O processo de desmontagem leva aproximadamente três semanas, o que exige planejamento prévio. Permitindo uma análise morfométrica 3D precisa, essa plataforma conecta a estrutura dos fibroblastos às funções, avançando insights sobre homeostase tecidual e um mecanismo Z.