Name: Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-03T12:53:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a isolar ilhotas pancreáticas de ratos Lewis com alta pureza e viabilidade usando digestão enzimática e gradiente de densidade. Este protocolo padronizado maximiza o rendimento e a longevidade funcional para pesquisa em diabetes e transplante.

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<ol><li>Grattoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+cellular+therapeutics+for+type+1+diabetes+mellitus%3A+progress%2C+challenges%2C+and+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Harnessing cellular therapeutics for type 1 diabetes mellitus: progress, challenges, and the road ahead.</a> Nat Rev Endocrinol. 21 (1), 14-30 (2025).</li>
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<li>Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+variability+limits+reproducibility+in+rat+islet+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation variability limits reproducibility in rat islet studies.</a> PLoS One. 14 (5), e0216136(2019).</li>
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<li>Dono, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+collagenase+digestion+for+islet+isolation+from+48-hour+cold-preserved+rat+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Low temperature collagenase digestion for islet isolation from 48-hour cold-preserved rat pancreas.</a> Transplantation. 57 (1), 22-26 (1994).</li>
<li>Shapiro, A. M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+distension+and+warm+incubation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">High yield of rodent islets with intraductal collagenase distension and warm incubation.</a> Cell Transplant. 5 (6), 631-638 (1996).</li>
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<li>Kenyon, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+function+of+intrahepatic+islet+allografts+in+rhesus+monkeys+treated+with+humanized+anti-CD154%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized anti-CD154.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (14), 8132-8137 (1999).</li>
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<li>Paez-Mayorga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neovascularized+implantable+cell+homing+encapsulation+platform+with+tunable+local+immunosuppressant+delivery+for+allogeneic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Neovascularized implantable cell homing encapsulation platform with tunable local immunosuppressant delivery for allogeneic cell transplantation.</a> Biomaterials. 257, 120232(2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>21 G x 2 pol. Agulha BD PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305129</td><td></td></tr><tr><td>500 & micro; m Estrutura de latão e tela de aço inoxidável 304, 3" de diâmetro x 1" de profundidade (peneira número 35)</td><td>McMaster-Carr</td><td>34735K525</td><td></td></tr><tr><td>Seringas Air-Tite Estéreis, trava Luer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-178</td><td></td></tr><tr><td>Biogel PI UltraTouch M</td><td>M&ouml; Inlycke</td><td>42665</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Bonn; Direto; Pontas Afiadas; Comprimento da lâmina de 15 mm; 3 1/2" de comprimento total</td><td>Roboz</td><td>RS-5840</td><td></td></tr><tr><td>Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERIL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9956482</td><td></td></tr><tr><td>Série Cell-IQ 5,8 pés cúbicos Incubadora de Laboratório de CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVHL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura Corning 100 mm Não tratado com TC</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal Bovino Corning, 500 mL, Regular, Testado de Segurança pelo USDA (Inativado por Calor)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente do Ilhéu Corning 1,069 (densidade 1,069 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-815-CIS</td><td>Requer um pedido especial da empresa</td></tr><tr><td>Gradiente do Ilhéu Corning 1,096 (densidade 1,096 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-691-CIS</td><td>Requer um pedido especial da empresa</td></tr><tr><td>Gradiente da Ilhota de Corning 1,108 (densidade 1,108 g/cm3)</td><td>Corning</td><td>99-692-CIS</td><td>Requer um pedido especial da empresa</td></tr><tr><td>Placas Terras Covidien</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-225-102</td><td></td></tr><tr><td>DNase I Grau II</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Tubos centrífugos cônicos de alta clareza de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Papel alumínio Fisherbrand, Rolo de Bitola Padrão</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Esponjas de gaze não tecidas</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-028-559</td><td></td></tr><tr><td>Béqueres de vidro reutilizáveis Fisherbrand de Baixa Forma Resistente e Resistente</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101600</td><td></td></tr><tr><td>Mircoscópio de fluorescência &nbsp; BZ-X810</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Solução de glicose</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Microagulha Halsey</td><td>Ferramentas Científicas Finas</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, cálcio, magnésio, sem fenólico vermelho</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Hemostática Classic Crile 5-1/2 polegada de comprimento</td><td>McKesson</td><td>1231217</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Hudson (Ewald)</td><td>Roboz</td><td>RS-5238</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Hipodermica Monoject de 1-1/2 polegada de comprimento 16 Gauge Parede Regular sem segurança</td><td>McKesson</td><td>43481</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Liberase T-Flex, Grau de Pesquisa</td><td>Roche</td><td>5989132001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidade VIVA/MORTO/Citotoxicidade, para células de mamíferos</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; L3224</td><td></td></tr><tr><td>Pacote de software MATLAB</td><td>MathWorks</td><td><a href="https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML">https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML</a></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Seringa Programável NE-4000 de Dois Canais</td><td>Bomba de Seringa</td><td>NE-4000-US</td><td></td></tr><tr><td>AGULHA, HIPO STR DISP 27GX1/2" (100/BX) EXLINT</td><td>McKesson</td><td>408877</td><td></td></tr><tr><td>Cultura Celular/Placas de Petri Nunc</td><td>Termo-Científica</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Olympus CKX41 de Contraste de Fase Invertido</td><td>Olympus</td><td>CKX41-B</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina' Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, sem glicose</td><td>Gibco</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio (estoque de 100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST 16R</td><td>Termo-Científica</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de seringa 304 de aço inoxidável</td><td>Milipore Sigma</td><td>Z117013-1EA</td><td></td></tr><tr><td>DRAPE CIRÚRGICO, DESCARTÁVEL, 36 IN X 100 YD</td><td>Covetrus</td><td>10408</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica - ToughCut</td><td>Ferramentas Científicas Finas</td><td>14054-13</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de curativo para polegar de 4,5" com delicados 1,3 mm de largura de ponta</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga Thermo Scientific Nunc 200mL</td><td>Termo-Científica</td><td>14-962-17</td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores e Almofadas para Garrafas de Centrífuga Thermo Scientific Nunc</td><td>Termo-Científica</td><td>12-565-283B</td><td></td></tr><tr><td>TSDUB15 15L Dubnoff Banho-Mariá Agitante</td><td>Fisher Scientific</td><td>300610298</td><td></td></tr><tr><td>TX-400 4 x 400 mL Rotor de balde oscilante</td><td>Termo-Científica</td><td>75003181</td><td></td></tr><tr><td>Tygon S-50-HL</td><td>Tygon</td><td>AAXoooo3</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA de Insulina Ultra Sensível para Ratos</td><td>Química de Cristal</td><td>90060</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Pancreatic Islet Isolation and Purification from Lewis Rats Using Enzymatic Digestion and Density-Gradient Separation

Os resultados a seguir representam um isolamento típico de ilhotas realizado usando o método descrito, com doze pâncreas de rato Lewis processados em paralelo.
Distribuição de rendimento e tamanho
Contagem manual de alíquotas e conversão IEQ
Duas alíquotas independentes de 100 μL foram obtidas da suspensão mista de ilhéus, conforme descrito na seção "Contagem de Ilhéus", Passo 6.1, e contadas por compartimentos de diâmetro (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm). As contagens foram convertidas para equivalentes em ilhotas (IEQ; referência de 150 μm) usando tabelas de equivalência padrão e extrapoladas para o volume total de suspensão (ver Figura 4A). Em todo o isolamento de teste (n = 12), o rendimento foi de 3330 IEQ/pâncreas com diâmetro mediano da ilhéu no compartimento de 50-100 μm. Replicar alíquotas concordadas em 18,8% por bin (coeficiente de variação), indicando variação moderada, mas esperada com o uso de métodos manuais de contagem. Nos 14 isolamentos anteriores de ilhéus, esse método produziu uma média de 1353 (SD 607) IEQ/pâncreas.
Quantificação automatizada de placas inteiras
Para comparar IEQ manual, imagens em campo claro foram adquiridas em D1 usando um microscópio e costuradas para gerar compósitos de prato inteiro (4× objetiva; 1/100 de s). O dimensionamento automatizado e a quantificação de objetos foram realizados usando Fiji e codificação com um limiar de tamanho pré-definido de 50-600 μm. As imagens foram primeiro pré-processadas para reduzir a variação do fundo e melhorar a uniformidade do contraste. Estruturas de ilhotas foram identificadas com base nas diferenças de intensidade em relação ao tecido ao redor, gerando máscaras binárias de objetos. Ilhotas adjacentes ou parcialmente tocadas foram separadas para evitar subestimação do número de objetos. Objetos fora da faixa de tamanho especificada foram excluídos para remover detritos e tecido não ilhéu. Para cada objeto retido, parâmetros morfométricos incluindo área e diâmetros dos eixos x e y foram extraídos. As ilhotas eram então agrupadas por diâmetro, e o IEQ era calculado multiplicando o número de ilhotas em cada compartimento de tamanho pelo fator de conversão correspondente. O dimensionamento automatizado resultou em 98.832 objetos totais, com diâmetros médios nos eixos x e y de 117 μm e 116 μm, respectivamente, e um total estimado de 16.350 IEQ, o que se correlacionou fortemente com IEQ manual medido em D0 (Spearman r = 0,937, p = 0,0048; veja a Figura 4A-C).
Perda de células de ilhotas
Imagens da placa inteira foram obtidas 2 horas após a purificação e novamente no Dia 1 (D1), usando a mesma metodologia em "Quantificação automatizada da placa inteira" para avaliar a estabilização precoce da ilha ("shedding"). A contagem de objetos mudou 0,9% e o IEQ em -6,11% de 2 h para D1 (veja a Figura 4D). A comparação pareada dos diâmetros das ilhotas entre D0 e D1 mostrou uma diminuição mediana estatisticamente significativa de 2 μm (teste de Wilcoxon signed-rank, p = 0,0136, n = 2820). No entanto, a pequena magnitude dessa mudança provavelmente não será biologicamente ou clinicamente significativa.
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70414/70414fig4.jpg" data-altupdatedat="1777957239000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Avaliação quantitativa da distribuição do tamanho das ilhagas, correlação e queda precoce de ilhéus. Resumo gráfico das medições de ilhotas obtidas por meio de análises manuais e automatizadas. (A) Distribuição do tamanho dos ilhotes no dia 0 (D0) baseada em quantificação manual entre caixas de tamanho IEQ equivalentes a ilhotas padronizadas. (B) Dia 1 (D1) distribuição do tamanho das ilhotas determinada por medições automatizadas baseadas em imagens nos mesmos compartimentos padronizados de tamanho IEQ. (C) Correlação das contagens entre a quantificação manual de D0 e a quantificação automática de D1 entre os bins de tamanho IEQ. (D) Gráfico de caixa da distribuição dos diâmetros das ilhotas entre D0 e D1 para medições automatizadas da mesma placa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70414/70414fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
Pureza (conteúdo endócrino vs. exócrino)
Coloração por ditizona (DTZ)
Em D1, uma alíquota de ilhéus (n = 451) foi tingida com DTZ por 30 s à temperatura ambiente e imediatamente fotografada usando microscopia de campo claro (objetivo 4×; exposição de 1/20 s). Em Fiji, os pixels de fundo foram removidos de modo que a área restante do pixel correspondesse à área total do ilhéu. Regiões de tecido exocrino DTZ-negativo, identificadas por contraste de cor mais escuro, foram selecionadas manualmente usando uma ferramenta laço, e a área de cada região de interesse foi automaticamente registrada em pixels. A pureza endócrina foi calculada como a porcentagem de pixels DTZ positivos em relação ao total de pixels das ilhetas, resultando em uma pureza de 98,56 ± 0,38% (Figura 5A).
Viabilidade e desempenho funcional
Secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS)
Em cada ponto temporal (D1, D3, D7), 15 ilhéus de tamanho parecido foram escolhidos à mão e colocados em poços individuais de uma placa de 24 poços, preparados em quadruplicado. As ilhotas foram incubadas a 37 °C 5% CO2 no tampão de Krebs sob protocolo de estimulação de glicose baixa-alta-baixa: primeiro em glicose baixa (2,8 mM, 60 min), seguida por glicose alta (16,7 mM, 60 min, ver Tabela 1). Frações de efluente foram coletadas ao final de cada período de incubação, e as concentrações de insulina foram quantificadas usando um ensaio ELISA de insulina em rato. Os índices de estimulação foram calculados como a razão de secreção de insulina durante condições de glicose alta e baixa. Os índices de estimulação foram 9,37, 8,34 e 6,7, nos dias 1, 3 e 7, respectivamente, sem diferenças significativas (Figura 5B).
Mancha viva/morta
Em D1, D3 e D7, 15 ilhotas foram escolhidas a dedo e tingidas com o kit de viabilidade Viva/Morto conforme as instruções do fabricante. Brevemente, ilhotas foram incubadas na solução de coloração Live/Dead por 30 minutos a 25 °C, depois selecionadas sob configurações consistentes de microscópio para garantir comparabilidade entre pontos de tempo (objetivo 4X; exposição de 1/30 s, filtros Texas Red e GFP). A viabilidade foi quantificada usando um script Python que empregava scikit-image para segmentação de ilhotas e medição de fluorescência. Ilhotas foram identificadas combinando os canais de fluorescência verde e vermelho, aplicando o método de limiar de Li para gerar uma máscara binária e usando segmentação de bacia hidrográfica para separar ilhotas que se tocam. Os objetos foram filtrados por área para excluir detritos e artefatos. Para cada ilhéu, a viabilidade foi calculada como a porcentagem da densidade integrada viva (pixels verdes) em relação à densidade integrada total (pixels verdes mais vermelhos). Os resultados mostraram viabilidade de 68 ± 9% no D1, 98,2 ± 0,6% no D3 e 100% no D7. Uma amostra controle positiva tratada com etanol a 70% por 10 minutos apresentou viabilidade de 2,7 ± 7,2% (ver Figura 5C-F).
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70414/70414fig5.jpg" data-altupdatedat="1777957239000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Avaliação da pureza, viabilidade e resposta funcional das ilhéutas. Imagens representativas e resumos quantitativos das características das ilhotas isoladas ao longo do tempo. (A) Imagem representativa de campo claro 10× ilhéus tingidos com dithiza (DTZ), mostrando ilhéus endócrinos tingidos de vermelho e tecido exocrino não corado. (B) Valores de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) do índice de estimulação de glicose alta/baixa glicose (HG/LG) para os dias 1, 3 e 7. (C-E) Imagens de fluorescência viva/morta de ilhotas no Dia 1 (C), Dia 3 (D) e Dia 7 (E). (F) Imagem de fluorescência viva/morta de ilhéus de controle positivo tratados com etanol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70414/70414fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(A) Mídia de Lavagem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentração final</td>
			<td>Valor (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soro Fetal Bovino</td>
			<td>10%</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (10.000 U/mL)</td>
			<td>1%</td>
			<td>5,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>12,5 mL de estoque de 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>5 mL de estoque de 200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Mídia da Cultura de Ilhotas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentração final</td>
			<td>Quantidade (mL ou g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640, Sem glicose</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soro Fetal Bovino</td>
			<td>10%</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (10.000 U/mL)</td>
			<td>1%</td>
			<td>5,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>11 mL a partir de estoque de 1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piruvato de Sódio</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>5,5 mL a partir de estoque de 100 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicose</td>
			<td>5,5 mM</td>
			<td>2,75 mL a partir de estoque de 200 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Solução de Enxágue de Penicilina e Estreptomicina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentração final</td>
			<td>Quantidade (mL ou g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solução salina, 0,9%</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estreptomicina penicilinosa (10.000 U/mL)</td>
			<td>2%</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(D) Amortecedora de extinção</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentração final</td>
			<td>Quantidade (mL ou g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soro Fetal Bovino</td>
			<td>20%</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>2.50%</td>
			<td>2,5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(E) Buffer de Krebs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentração final</td>
			<td>Quantidade (mL ou g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dH2O</td>
			<td>-</td>
			<td>975 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>115 mM</td>
			<td>6,72 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>24 mM</td>
			<td>2,02 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0,3728 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0,0952 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>0,2775 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista de soluções. Detalhes de composição e preparação para todas as soluções utilizadas ao longo do protocolo de isolamento e purificação de ilhéus. Cada subseção lista componentes, concentrações finais, volumes de preparação e números de catálogo. (A) Mídia de lavagem, usada para enxáguar e lavar tecido durante a digestão e purificação. (B) Mídia de Cultura de Ilhotes, usada para manutenção e viabilidade pós-isolamento. (C)Solução de enxágue de penicilina e estreptomicina, usada para esterilizar e enxaguar pâncreas colhidos. (D) Tampão de Extinção, usado para interromper a digestão enzimática e preservar a viabilidade celular. (E) Tampão de Krebs, usado durante ensaios de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS).
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Número de pâncreas</td>
			<td>Colagenase (15,38 mg/mL)</td>
			<td>Termolisina (1 mg/mL)</td>
			<td>DNAse (100 mg/mL)</td>
			<td>Buffer de funcionamento</td>
			<td>600 mL de béqueres para uso</td>
			<td>Volume/Béquer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>4,5 mL</td>
			<td>2,25 mL</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>450 mL</td>
			<td>5</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>3,6 mL</td>
			<td>1,8 mL</td>
			<td>360 μL</td>
			<td>360 mL</td>
			<td>4</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>3 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>300 μL</td>
			<td>300 mL</td>
			<td>3</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>2,4 mL</td>
			<td>1,2 mL</td>
			<td>240 μL</td>
			<td>240 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>1,8 mL</td>
			<td>0,9 mL</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>180 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>0,75 mL</td>
			<td>150 μL</td>
			<td>150 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentração final.</td>
			<td>0,15 mg/mL</td>
			<td>5 mg/mL</td>
			<td>0,1 mg/mL</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Solução enzimática digestiva por quantidade de pâncreas. Volumes de colagênase, termolisina e DNase foram necessários para preparar o Meio de Dissociação de Trabalho (WDM) para diferentes números de pâncreas de rato. As concentrações finais de cada enzima estão listadas na parte inferior da tabela.
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Número de pâncreas</td>
			<td>Tubos número 50 mL</td>
			<td>Volume/ seringa</td>
			<td>Número de 1,096 seringas</td>
			<td>Número de 1,068 seringas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>10 tubos</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>8 tubos</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>6 tubos</td>
			<td>30 mL</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td>4 válvulas</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>4 válvulas</td>
			<td>40 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>2 tubos</td>
			<td>20 mL</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Carga em gradiente por quantidade do pâncreas. Número de tubos cônicos de 50 mL e volumes de gradiente correspondentes necessários para a purificação das ilhotas com base no número de pâncreas processados.
<table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Faixa de Diâmetro das Ilhotas (μm)</td>
			<td>Número de Partículas de Ilhotas (IA)</td>
			<td>Fator de Conversão IEQ</td>
			<td>IEQ por faixa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-100</td>
			<td>a</td>
			<td>* 0.167</td>
			<td>a * 0,167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>b</td>
			<td>* 0.648</td>
			<td>b * 0,648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-200</td>
			<td>c</td>
			<td>* 1.685</td>
			<td>c * 1.685</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>201-250</td>
			<td>d</td>
			<td>* 3.500</td>
			<td>d * 3.500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>251-300</td>
			<td>e</td>
			<td>* 6.315</td>
			<td>e * 6.315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-350</td>
			<td>f</td>
			<td>* 10.352</td>
			<td>f * 10.352</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt; 350</td>
			<td>g</td>
			<td>* 15.833</td>
			<td>g * 15.833</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Conversão de equivalência de ilhéus. A conversão de diâmetros de ilhotas varia para equivalentes padronizados de ilhotas (IEQ). A tabela lista os compartimentos de diâmetro de ilhotas observados, o número de partículas de ilhotas por intervalo, o fator de conversão IEQ correspondente para cada faixa de tamanho e a contribuição resultante de IEQ por intervalo.

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