Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Nossa pesquisa foca no desenvolvimento de um protocolo padronizado de isolamento de ilhós Lewis Rat de alto rendimento para otimizar rendimento, pureza, viabilidade e longevidade funcional. Métodos existentes produzem ilhós variáveis impuros e de vida curta. Esse protocolo padroniza digestão, purificação e agrupamento para melhorar a consistência e a longevidade.

Para começar, coloque um rato eutanasiado sob um microscópio. Usando tesoura de pele, faça uma incisão em V começando pela síntese pubiana em direção a cada caixa torácica lateral para acessar a cavidade abdominal. Usando pinças planas, retraa o intestino delgado e grosso para o lado esquerdo do animal para liberar o espaço de trabalho da cavidade abdominal.

Depois, use a pinça plana e os hemostáticos curvos para abrir o duodeno superior. Certifique-se de que o ducto biliar comum e a veia porta hepática estejam dentro do campo de visão. Agora use os hemostatos curvos para retrair o fígado na direção dos cefalões.

Clampe o ducto biliar comum e a veia hepática de um a dois milímetros do fígado. Sob a visão do microscópio, com pinças planas e hemostatos planos, mobilize suavemente o conteúdo dentro do duodeno para eliminar o esfíncter do audi. Depois, prenda suavemente o duodeno aproximadamente cinco milímetros de cada lado do esfíncter do Audi para isolar a região ao redor.

Garanta compressão mínima para preservar a integridade dos tecidos. Insira cuidadosamente a agulha de uma seringa contendo WDM estéril através da parede duodenal. Passe a agulha pelo corpo do esfíncter e avance para o ducto pancreático principal para perfusão.

Mantendo pressão constante, perfunda de sete a dez mililitros de WDM no pâncreas a uma taxa de cerca de 500 microlitros por segundo até que o pâncreas esteja totalmente distendido. Agora, remova ambos os hemostatos planos do duodeno. Depois, disseque e liberte suavemente o pâncreas das estruturas ao redor, começando pelo baço, estômago, intestino grosso, duodeno e mesentar.

Levante suavemente o pâncreas perfuso com pinças planas e use tesouras finas de dissecação para cortar quaisquer fixações restantes do tecido conjuntivo. Transfira imediatamente o pâncreas excisado para uma placa de Petri contendo solução de enxágue gelada e prossiga para colher o próximo pâncreas enquanto o pâncreas extirpado está sendo limpo. Para limpar o pâncreas, use um par de pinças finas curvas e tesouras finas de dissecação para remover cuidadosamente linfonodos, tecido adiposo, mestrógeno e vasos vasculares grandes do pâncreas perfuso, se presente.

Transfira o pâncreas limpo para um béquer estéril de 600 mililitros contendo 25 mililitros de WDM frio. Cubra o béquer com papel alumínio estéril para manter a limpeza durante a transferência do espaço cirúrgico para o espaço de cultivo celular. Transfira o béquer para um banho-maria com shaker orbital ajustado a 130 rotações por minuto durante 10 minutos.

No marco dos cinco minutos, gire manualmente o béquer no sentido horário e depois no sentido anti-horário para ajudar na dissociação dos tecidos. Ao minuto 10, transfira rapidamente o béquer e mergulhe-o no gelo para desacelerar a atividade enzimática. Depois, adicione um volume igual de tampão de tampão de tampão de tampão à solução no béquer para interromper a digestão.

Usando uma seringa de 50 mililitros equipada com uma agulha espinhal calibre 14, aspire e expele suavemente a suspensão tecidular repetidamente para dissociar grandes fragmentos de tecido. Transfira a suspensão para tubos cônicos de 200 mililitros. Após centrifugar a suspensão, decante cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 mililitros de meio de lavagem.

Agora filtre a suspensão por meio de uma peneira estéril de 500 micrômetros colocada sobre um béquer estéril de 600 mililitros para remover o tecido grande e não digerido. Transfira o filtrado para novos tubos cônicos de 200 mililitros antes de centrifugar novamente. Para a purificação do ilhó, utilize uma pipeta sorológica pré-casada de 10 mililitros para resuspender cada pellet de tecido em 15 mililitros de solução gradiente por dois mililitros de volume do pellet.

Misture suavemente até que a suspensão fique uniforme. Dispense cuidadosamente 15 mililitros da suspensão da célula no fundo de cada tubo cônico de 50 mililitros, evitando contato com as paredes do tubo para garantir gradientes limpos. Depois, use uma bomba de seringa para dispensar 10 mililitros de cada gradiente a uma taxa de cinco mililitros por minuto, posicionando a ponta da agulha calibre 16 contra a parede interna do tubo para evitar a mistura.

Após centrifugar os tubos, identifique a camada de ilhó localizada nas interfaces entre as camadas de gradiente. Usando uma pipeta de passadeira de calda, colete a camada de ilhós e transfira os ilhós coletados para um tubo cônico pré-resfriado de 200 mililitros contendo cinco mililitros de meio de lavagem. Aumente o volume para 200 mililitros com o meio de lavagem e execute os seguintes passos de lavagem e centrifugação.

Depois, placar uniformemente os ilhós em placas de Petri de 100 milímetros tratadas sem cultura tecidual, usando uma placa para cada cinco pâncreas processados. Em todo o isolamento de teste, o rendimento foi de 3.330 equivalentes de ilhós por pâncreas, com diâmetro mediano de ilhó no compartimento de 50 a 100 micrômetros. O dimensionamento automatizado resultou em 98.832 objetos no total, o que se correlacionou fortemente com os equivalentes manuais das pálpebras medidos no dia zero.

A pureza endócrina era de cerca de 98,56%, baseada na coloração por ditozônio no primeiro dia. Os índices de estimulação foram 9,37 no primeiro dia, 8,34 no terceiro dia e 6,7 no sétimo dia, sem diferenças significativas entre os pontos de tempo. Esse método possibilita o estudo do transplante de olhos, função das células beta, reversão do diabetes, encapsulamento dos ilhós e interações imunes ou microambientais dos olhos.

Esse protocolo pode ser aplicável a transplantes pré-clínicos, modelagem de diabetes, estudos de encapsulamento e ensaios funcionais in vitro que exigem ilhós Lewis Rat de alta pureza.