Protocolo para Dissociação de Célula Única, Sequenciamento de RNA e Isolamento de Células Mioepiteliais e Fibroblastos das Glândulas Lagrimais e Salivares Envelhecidas
April 24th, 2026
Este protocolo descreve um método otimizado para dissociar glândulas lacrimais de camundongos envelhecidos para obter células individuais viáveis para sequenciamento de RNA unicelular. Digestão enzimática sequencial e manuseio suave preservam a integridade celular, resultando em suspensões de alta qualidade adequadas para isolamento específico por tipo celular e análise transcriptômica de alterações associadas ao envelhecimento nas populações de glândulas lacrimais.
Meu laboratório estuda como as mudanças relacionadas à idade nas glândulas salivares e lacrimais afetam diferentes tipos celulares usando citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular. Métodos padrão de dissociação recuperam mal células epiteliais frágeis de glândulas salivares e lacrimais envelhecidas. E meu protocolo melhora a viabilidade das células e permite uma análise e separação de células únicas confiáveis.
Para começar, posicione o camundongo eutanasiado em deitado na mesa de dissecação. Usando pinças finas e tesouras, incida a pele entre o olho e a orelha. Retraa suavemente a pele para expor a glândula lacrimal.
Usando pinças de ponta cega, levante levemente a glândula lacrimal. Separe cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor, provocando-o suavemente em um movimento circular. Identifique os limites visíveis da glândula lacrimal e separe-a dos tecidos adjacentes, incluindo a glândula parótida.
Depois, transfira a glândula lacrimal para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo dois mililitros de PBS frio sobre gelo. Sob um microscópio dissecador, remova a gordura restante e cuidadosamente remova a cápsula de tecido conjuntivo da glândula lacrimal. Coloque uma placa de Petri estéril de 35 milímetros sobre gelo.
Adicione de 800 a 1000 microlitros de PBS frio ao centro do recipiente e transfira uma glândula lacrimal para o PBS. Certifique-se de que o tecido permaneça submerso em PBS. Usando dois bisturis estéreis, triture finamente a glândula lacrimal em pequenos fragmentos até que ela atinja uma consistência macia e pastosa.
Recolha os fragmentos de tecido em um dos lados do prato. Aspire o PBS residual e lave os fragmentos com um mililitro de PBS fresco e frio. Transfira os fragmentos de tecido lavados para uma placa de 12 poços contendo dois mililitros por poço de meio de digestão pré-aquecido.
Coloque o prato em um banho-maria agitante e incube a 37 graus Celsius e 60 rotações por minuto durante 30 minutos. Usando uma ponta de pipeta de um mililitro de grande calibre, triture suavemente o tecido 15 vezes. Volte a placa ao banho-maria agitada e incube por mais 30 minutos.
Em seguida, usando uma ponta comum de um mililitro de pipeta, triture suavemente a amostra 10 vezes e incube novamente por 30 minutos. Depois, triture suavemente a amostra 10 vezes e transfira a suspensão da célula para tubos microcentrífugas dolphin de dois mililitros. Adicione um mililitro de meio bloqueador a frio um, ou BM1, a cada poço da placa para coletar o meio digestivo restante contendo células residuais e coloque a placa no gelo até a próxima etapa.
Centrifuge os tubos que contêm a suspensão da célula a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante de cada tubo. Transfira o BM1 de cada poço da placa contendo células residuais para o tubo correspondente.
Em seguida, adicione 600 microlitros de BM1 frio em cada poço para enxaguar as células restantes e transfira a lavagem para o tubo correspondente para combinar com a suspensão da célula. Suspenda suavemente a suspensão da célula. Centrifuge os tubos novamente a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante.
Adicione um mililitro de Accutase aos pellets celulares e ressuspenda suavemente as células. Incube o tubo a 37 graus Celsius e 60 rotações por minuto por cinco a dez minutos. Usando uma ponta de pipeta de um mililitro, triture suavemente a amostra 10 vezes.
Depois, adicione um mililitro de BM2 frio ao tubo para terminar a reação enzimática diluindo a Accutase. Centrifuge o tubo a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Adicione meio contendo DNase 1 em concentração de 200 unidades por mililitro ao tubo para ressuspender as células e encher o tubo até o topo.
Incube o tubo por 10 minutos em temperatura ambiente e suspenda suavemente uma vez após cinco minutos. Enquanto isso, coloque um filtro de célula de 70 micrômetros sobre um tubo cônico de 15 mililitros e pré-umeça o escorredor com um mililitro de BM3. Após a incubação, transfira a suspensão celular para o peneirador.
Adicione um mililitro de BM3 no tubo original de coleta para enxaguar e transfira o enxágue para a mesma peneira. Lave o peneiro com mais cinco mililitros de BM3. Por fim, determine a concentração celular e a viabilidade da suspensão celular filtrada usando coloração azul de tripano e um contador celular automatizado.
Prossiga com aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA de célula única para perfil de expressão gênica, ou triagem celular baseada em citometria de fluxo de populações celulares marcadas fluorescente. A análise UMAP dos dados de sequenciamento de RNA unicelular identificou populações epiteliais e estromais bem representadas na glândula lacrimal, incluindo células mioepiteliais e fibroblastos, bem como diversas populações de células imunes. Glândulas lacrimais envelhecidas continham plasma abundante e células B ativadas expressando IGHM e IGHD.
A citometria de fluxo sequencial permitiu a separação clara de células mioepiteliais positivas para EpCAM e GFP das células mural negativas para EpCAM e positivas para GFP. Fibroblastos GFP-positivos que expressam PDGFR alfa eram EpCAM negativos, permitindo a discriminação das células epiteliais. Em camundongos PDGFR alfa e EGFP, todas as células positivas para GFP também expressaram colágeno um, confirmando a identidade dos fibroblastos.
A análise de citometria de fluxo mostrou que 99,6% das células positivas para GFP correspondiam a células imuno-coloridas por PDGFR alfa. Esse protocolo foi desenvolvido para isolar células individuais viáveis de glândulas lacrimais para caracterização molecular de populações epiteliais, estromais e imunes. O principal desafio é minimizar o estresse mecânico e enzimático durante a dissociação de tecidos frágeis envelhecidos, ao mesmo tempo em que se mantém alta viabilidade celular para o sequenciamento de RNA unicelular.
Seguindo esse procedimento, células isoladas podem ser usadas para sequenciamento de RNA de célula única, sequenciamento de RNA em massa e perfilamento molecular de populações celulares específicas. Células ordenadas também podem ser cultivadas para ensaios funcionais posteriores.
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Overview
This article presents an optimized protocol for isolating viable single cells from aged mouse lacrimal glands (LGs), enabling high-quality single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and flow cytometry analysis. The method addresses challenges posed by increased fibrosis, cellular fragility, and lipid accumulation in aged LGs, ensuring efficient dissociation and recovery of diverse cell types for downstream molecular profiling.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular biology
- Ophthalmology and exocrine gland research
- Single-cell transcriptomics
Background
- Aging of the lacrimal gland leads to reduced tear secretion and chronic inflammation, contributing to dry eye disease.
- Age-related changes include immune cell infiltration, cellular damage, lipid accumulation, extracellular matrix deposition, and ductal dilation.
- Single-cell RNA sequencing is a powerful tool for profiling cellular heterogeneity and transcriptional changes during aging.
- Obtaining viable single-cell suspensions from aged LGs is technically challenging due to tissue fragility and fibrosis.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for efficient dissociation of aged mouse lacrimal glands.
- To enable isolation of multiple cell types suitable for scRNA-seq and flow cytometry.
- To minimize cell damage and maximize viability during tissue processing.
Methods Used
- Careful dissection and mincing of lacrimal gland tissue from euthanized mice.
- Stepwise enzymatic digestion using Collagenase IV, Dispase II, DNase I, and Accutase.
- Use of pre-coated plasticware and controlled temperature/agitation to reduce cell stress.
- Red blood cell lysis and sequential filtration through strainers to enhance cell purity.
- Cell type-specific isolation using reporter mouse lines (Acta2GFP and PdgfraEGFP) and fluorescence-activated cell sorting (FACS) after immunostaining with EpCAM antibody.
Main Results
- The protocol yields high-quality, viable single-cell suspensions from both aged and young lacrimal glands.
- UMAP analysis of scRNA-seq data identified well-represented epithelial, stromal, and diverse immune cell populations.
- FACS enabled clear separation and identification of myoepithelial cells (EpCAM+, GFP+) and fibroblasts (PDGFRα+, EpCAM-).
- In aged LGs, abundant plasma and activated B cells expressing IGHM and IGHD were detected.
- 99.6% of GFP-positive cells corresponded to PDGFRα-immunostained fibroblasts, confirming cell identity.
Conclusions
- This protocol enables efficient and gentle dissociation of aged lacrimal glands for single-cell analysis.
- It supports high cell viability and recovery of multiple cell types, including fragile epithelial and stromal populations.
- The method is adaptable to other fibrotic or aging exocrine tissues requiring targeted cell isolation.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Efficient single-cell dissociation and isolation from aged lacrimal and salivary glands addresses a critical bottleneck in profiling cellular heterogeneity and transcriptional changes associated with tissue aging and fibrosis. This protocol enables high-viability recovery of fragile epithelial and stromal populations, supporting robust single-cell RNA sequencing and targeted cell sorting for discovery-stage research. The method enhances predictive confidence in cell-type specific molecular characterization, informing early target validation and mechanistic de-risking in exocrine gland disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of age-related cellular and molecular changes in exocrine tissues.
- Supports functional target validation by isolating viable myoepithelial cells and fibroblasts for downstream analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing high-quality single-cell suspensions for transcriptomic profiling.
- Improves predictive confidence in disease-relevant system modeling for dry eye and related disorders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell suspensions suitable for high-throughput scRNA-seq and flow cytometry workflows.
- Standardizes dissociation and isolation steps to maximize reproducibility and quantitative output quality.
- Enables reliable cell-type specific sorting using FACS and reporter mouse lines for assay development.
- Supports scalable adaptation to other fibrotic or aging exocrine tissues with similar dissociation challenges.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling outputs with disease-relevant biomarkers in aged tissue models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling functional assays on sorted cell populations.
- Reduces biological risk in translational studies by ensuring high cell viability and purity for downstream applications.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust single-cell analysis and targeted cell isolation from challenging aged tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in age-related exocrine gland dysfunction.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity single-cell suspensions for quantitative transcriptomic and cytometric assays.
- Analytics: Provides cell-type resolved molecular data and enables statistical comparison of cellular populations across age groups.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and functional validation in disease-relevant aged tissue models.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse exocrine tissues, supporting platform scalability and cross-program standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-type specific analyses.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of single-cell workflows in aged and fibrotic tissues.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage molecular profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of programs targeting exocrine gland dysfunction and aging.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, enzymatic dissociation, and flow cytometry-based cell sorting.
- Demands access to automated cell counters, FACS instrumentation, and single-cell RNA sequencing platforms.
- Necessitates cross-team standardization of dissociation and sorting protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissues may require optimization of enzyme concentrations and incubation times.
- Cell viability and yield may be limited by tissue fibrosis and cellular fragility in advanced aging models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:36
Lacrimal Gland Tissue Isolation from PdgfraEGFP Transgenic Mouse
1:38
Fragmentation of Harvested Lacrimal Gland Tissue
2:27
Enzymatic Digestion of the Tissue Fragments and Primary Washes
4:30
Accutase and DNase I Treatment
6:33
Results
7:58
Conclusion
