Síntese, encapsulamento de hemoglobina e PEGilação biortogonal em nanopartículas hierárquicas porosas de UiO-66 para aplicações de entrega de oxigênio

O objetivo desta pesquisa é definir uma estrutura metal-orgânica estável, baseada em nanopartícula baseada em MOF, para encapsulamento de hemoglobina e entrega de oxigênio. A morfologia porosa hierarch pode superar a limitação de tamanho do poste para encapsulamento de hemoglobina, e a população superficial pode aumentar a estabilidade das partículas em ambientes fisiológicos. Para começar, pesar com precisão 50 miligramas de nanopartículas de UIO 66, amina hierarquicamente porosas preparadas em um frasco redondo de fundo de 25 mililitros.

Adicione 10 mililitros de tetrahidrofurano ao frasco. Depois, ultrassonar a mistura por cinco minutos para dispersar completamente as partículas, produzindo uma suspensão opaca uniforme. Coloque o cantil de fundo redondo em um banho-maria com gelo em um agitador magnético ajustado para 400 RPM.

Usando uma seringa de vidro, adicione 0,4 mililitros de nitrito de tert butílico em gotas ao longo de cinco minutos, mantendo a temperatura abaixo de cinco graus Celsius. Adicione imediatamente 0,35 mililitros de trimetila SL azida em gota a gota sob as mesmas condições frias. Pode aparecer uma leve efervescência, indicando progresso de nitrosação.

Depois, envolva o banho-maria gelada em papel alumínio para proteger a reação da luz. Continue mexendo a mistura de reação no banho-maria gelada durante a noite. No dia seguinte, lave e seque o produto conforme mostrado.

Depois, use espectroscopia FTIR para verificar a transformação química. Transfira cinco miligramas de nanopartículas de azida UIO 66, hierarquicamente porosas, para um tubo centrífugo de dois mililitros. Adicione 0,5 mililitros de buffer HEPES e faça sonicação por dois a cinco minutos.

Adicione 0,5 mililitros de tampão HEPES contendo 20 miligramas por mililitro de hemoglobina e invista suavemente o tubo várias vezes para dispersar completamente as nanopartículas. Agora coloque o tubo em um shaker térmico e incube em temperatura ambiente, agitando a 1.000 RPM por duas horas. Após a incubação, centrifuge o tubo a 13.500 G por cinco minutos em temperatura ambiente, para pelletar as nanopartículas de azida UIO 66, carregadas hierarquicamente de hemoglobina.

Depois, colete cuidadosamente o sobrenadante para quantificar a hemoglobina não retida. Lave o pellet suavemente três vezes com um mililitro de água ultrapura, pipeteando para cima e para baixo para remover a hemoglobina absorvida de forma solta. Depois, colete cuidadosamente o sobrenadante de cada lavagem para quantificar a hemoglobina aprisionada.

Resuspenda o pellet final em 0,5 mililitros de água ultrapura e armazene em uma geladeira antes da caracterização. Use o ensaio de hemoglobina sulfato de louro sódico para determinar a hemoglobina aprisionada nos supernadantes coletados. Pipete 10 microlitros de cada sobrenadante em uma microplaca de 96 poços.

Adicione 100 microlitros de sulfato de louro de sódio e incube por cinco minutos em temperatura ambiente, no escuro. Usando um espectrofotômetro visível ultravioleta, meça a absorção a 412 nanômetros. Em seguida, prepare diluição serial do estoque de hemoglobina no buffer HEPES para gerar uma curva padrão.

Transfira as diluções preparadas para a placa de 96 poços preparada para gerar uma curva padrão para converter leituras de absorção em concentrações de hemoglobina. Transfira 10 miligramas das nanopartículas de azida UIO 66, carregadas hierarquicamente de hemoglobina, para um tubo centrífugo de dois mililitros, contendo 0,5 mililitros de água ultrapura, e sonice por dois a cinco minutos. Adicione 20 miligramas de dibenzociclooctano, modificado com polietilenoglicol para obter uma proporção equimolar de polietilenoglicol para nanopartículas.

Faça um vórtice suave no tubo até que a mistura fique homogeneizada. Coloque o tubo em um shaker térmico e incube em temperatura ambiente, agitando a 1.000 RPM por uma hora. Depois, transfira o tubo para uma geladeira mantida a quatro graus Celsius para uma reação durante a noite.

Centrifuge o tubo a 12.000 G por cinco minutos em temperatura ambiente para pelletar as nanopartículas UIO 66 modificadas com polietilenoglicol, carregadas de hemoglobina, hierarquicamente porosas. Depois, descarte o sobrenadante, que contém polietilenoglicol não reativo. Lave o pellet três vezes com água ultrapura de dois mililitros pipetando para cima e para baixo e centrifugando sob as mesmas condições demonstradas anteriormente.

Ressuspenda as nanopartículas purificadas de hemoglobina pegilada, hierarquicamente porosas, UIO 66, em dois mililitros de água ultrapura. Guarde a suspensão a quatro graus Celsius. O coloide resultante parece homogêneo e levemente opalescente, indicando boa estabilidade de dispersão.

Depois, confirme a pegilação bem-sucedida por espalhamento dinâmico da luz, ou DLS. Grupos amino de superfície foram convertidos com sucesso em azidetas. Isso foi demonstrado pelo aparecimento de uma característica azida assimétrica, faixa de estiramento em 2.122 centímetros inversos no espectro FTIR de nanopartículas azida UIO 66 hierarquicamente porosas.

Essa faixa estava ausente nas nanopartículas de amina UIO 66 hierarquicamente porosas. O encapsulamento da hemoglobina foi visualmente indicado por uma mudança distinta de cor amarela para vermelha. A captação de nitrogênio diminuiu após a carga de hemoglobina, indicando a ocupação dos mesóporos por moléculas de hemoglobina.

O potencial zeta das nanopartículas de azida UIO 66, hierarquicamente porosas, diminuiu de 42,9 milivolts para 20,4 milivolts após a encapsulação da hemoglobina. A conjugação bem-sucedida do polietilenoglicol foi confirmada pelo desaparecimento da vibração de estiramento das azidas em 2.122 centímetros inversos, e pelo aparecimento de sinais associados ao polietilenoglicol no espectro FTIR. A análise DLS mostrou um aumento no diâmetro hidrodinâmico de aproximadamente 114,9 para 140,8 nanômetros após a pegilação, mantendo um baixo PDI.

Essa partícula possibilita a síntese de nanopartículas morfo hierárquicas porosas, encapsulamento de hemoglobina, peculação superficial e a avaliação da funcionalidade de liberação de oxigênio. Usando esse protocolo, caracterização física e química adicional e estudos funcionais podem ser realizados, incluindo a análise da liberação in vitro de oxigênio e biocompatibilidade de nanopartículas. Estudos futuros podem focar na preservação da funcionalidade da hemoglobina por motivos mais longos, como incorporar componentes para evitar degradação substancial.