Name: Preparação otimizada de tecido pulmonar inteiro portador de tumor murino para citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T13:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Aprenda a isolar células únicas viáveis de pulmões murinos com tumor usando digestão enzimática otimizada e FACS. Este protocolo viabiliza análises de scRNA-seq com viabilidade superior a 85% para estudos de heterogeneidade tumoral.

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<ol><li>Leiter, A., Veluswamy, R. R., Wisnivesky, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+lung+cancer%3A+current+status+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The global burden of lung cancer: current status and future trends.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (9), 624-639 (2023).</li>
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<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
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<li>Cappuzzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET+increased+gene+copy+number+and+primary+resistance+to+gefitinib+therapy+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">MET increased gene copy number and primary resistance to gefitinib therapy in non-small-cell lung cancer.</a> Ann Oncol. 20 (2), 298-304 (2009).</li>
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<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+cancer+immunosurveillance+and+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting.</a> Immunity. 21 (2), 137-148 (2004).</li>
<li>Mittal, D., Gubin, M. M., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+cancer+immunoediting%3A+Elimination%2C+equilibrium+and+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New insights into cancer immunoediting: Elimination, equilibrium and escape.</a> Curr Opin Immunol. 27, 16-25 (2014).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 18 (1), 35-45 (2018).</li>
<li>Han, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+epithelial+cell+states+and+plasticity+in+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma.</a> Nature. 627 (8004), 656-663 (2024).</li>
<li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+and+spatial+atlas+of+TP53-associated+tissue+remodeling+defines+a+multicellular+tumor+ecosystem+in+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cancer%22%5BJournal%5D)">A cellular and spatial atlas of TP53-associated tissue remodeling defines a multicellular tumor ecosystem in lung adenocarcinoma.</a> Nat Cancer. 6 (11), 1857-1879 (2025).</li>
<li>Marjanovic, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+a+high-plasticity+cell+state+during+lung+cancer+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Emergence of a high-plasticity cell state during lung cancer evolution.</a> Cancer Cell. 38 (2), 229-246.e13 (2020).</li>
<li>Xie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLVAP+mediates+regulation+of+the+tumour+microenvironment+in+early-stage+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">PLVAP mediates regulation of the tumour microenvironment in early-stage lung adenocarcinoma.</a> Clin Transl Med. 15 (12), e70532(2025).</li>
<li>Fernandes, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+normal+and+KRASG12D-malformed+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of normal and KRASG12D-malformed lymphatic vessels.</a> JCI Insight. 10 (5), e185181(2025).</li>
<li>Pirrello, A., Killingsworth, M., Spring, K., Rasko, J. E. J., Yeo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+macrophage-like+cells+as+a+prognostic+biomarker+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Liquid+Biopsy%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated macrophage-like cells as a prognostic biomarker in solid tumors.</a> J Liquid Biopsy. 6, 100275(2024).</li>
<li>Rudnick, J. A., Debnath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+host+stromal+fibroblasts+supports+tumor+desmoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy in host stromal fibroblasts supports tumor desmoplasia.</a> Autophagy. 17 (12), 4497-4498 (2021).</li>
<li>Nissen, N. I., Karsdal, M., Willumsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagens+and+cancer-associated+fibroblasts+in+reactive+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Collagens and cancer-associated fibroblasts in reactive stroma.</a> J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 115(2019).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Morton, J., Snider, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+collection+and+processing+of+lungs+from+aged+mice+for+histological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiol+Aging+Age+Relat+Dis%22%5BJournal%5D)">Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies.</a> Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).</li>
<li>Pariollaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+disruption+enhances+HSF1+signaling+and+tumorigenesis+in+KRAS-driven+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Circadian disruption enhances HSF1 signaling and tumorigenesis in KRAS-driven lung cancer.</a> Sci Adv. 8 (39), eabo1123(2022).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+tumor+heterogeneity+and+microenvironment+in+advanced+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of tumor heterogeneity and microenvironment in advanced NSCLC.</a> Nat Commun. 12 (1), 2540(2021).</li>
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<li>Seltzer, J. L., Welgus, H. G., Jeffrey, J. J., Eisen, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ca2%E2%81%BA+in+mammalian+collagenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Role of Ca2⁺ in mammalian collagenase activity.</a> Arch Biochem Biophys. 173 (1), 355-361 (1976).</li>
<li>Shao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+expansion+of+type+II+alveolar+epithelial+cells+promotes+airway+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pharmacological expansion of type II alveolar epithelial cells promotes airway repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (16), e2400077121(2024).</li>
<li>Chen, Q., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse alveolar type II cells.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).</li>
<li>Arceneaux, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contamination-focused+approach+for+optimizing+single-cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A contamination-focused approach for optimizing single-cell RNA-seq experiments.</a> iScience. 26 (7), 107242(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Colanase Tipo IV</td><td>Sigma Aldich</td><td>C5138</td><td>Enzimas digestivas</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma Aldich</td><td>D4693</td><td>Enzimas digestivas</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>11284931001</td><td>Remover DNA</td></tr><tr><td>Filtro Falcon 70 Cell</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Remova tecido não digerido</td></tr><tr><td>Tesoura Estéril</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td>Tecidos cortados</td></tr><tr><td>Amortecedor de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Sigma Aldich</td><td>R7757</td><td>Remover células sanguíneas</td></tr><tr><td>FBS inativado ao calor</td><td>Phoenix Scientific</td><td>PS100</td><td>Proteger células</td></tr><tr><td>PBS livre de Ca+/Mg+</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>Enzimas dissolvidas/Células de lavagem</td></tr><tr><td>Agulha 21G de segurança multifly &nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>3051524</td><td>Perfusão corporal total</td></tr><tr><td>50 mL seringa &nbsp;</td><td>BD</td><td>300866</td><td>Perfusão corporal total</td></tr><tr><td>Antena de 6 cm</td><td>Corning</td><td>430116</td><td>Tecidos digestivos</td></tr><tr><td>Prato de 10 cm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Tecidos digestivos</td></tr><tr><td>Anticorpo de bloqueio Fc</td><td>BD</td><td>553141; RRID:AB_394655</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>BD</td><td>564907; RRID:AB_2869624</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD326</td><td>BD</td><td>563478; RRID:AB_2738234</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>HIVmPGKCre VSVG</td><td>UI Viral Vectore Core</td><td>VVC-U de Iowa-7556</td><td>Lentiviro</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo ZE5 (Yeti)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Mouse KrasLSL-G12D/+</td><td>Laboratório Jackson</td><td>008179; RRID:IMSR_JAX:008179</td><td></td></tr><tr><td>Rato repórter do TdTomato</td><td>Laboratório Jackson</td><td>007909; RRID:IMSR_JAX:007909&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação otimizada de tecido pulmonar inteiro portador de tumor murino para citometria de fluxo e sequenciamento de rna unicelular

Optimized Preparation of Whole Murine Tumor-Bearing Lung Tissue for Flow Cytometry and Single-Cell RNA-Sequencing

Preparação otimizada de tecido pulmonar inteiro portador de tumor murino para citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular

NSCLC accounts for approximately 85% of lung cancers, and Kirsten rat sarcoma (KRAS) is the most commonly mutated gene in NSCLC. Although management of ...

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Biologia

O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos...

Visualização melhorada de metástases pulmonares em Resolução única célula em Ratos por Combinado<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusão do tecido pulmonar e X-Gal coloração de<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Células Tumorais

Nós descrevemos o isolamento rápido de murinos primários células tipo II alveolares epiteliais (AECII) por meio de seleção por citometria de fluxo negativo. Estes AECII mostram viabilidade e pureza elevados e são adequadas para uma ampla gama de estudos funcionais e moleculares relativas ao seu papel em condições respiratórias, tais como doenças auto-imunes ou infecciosas.

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Este vídeo descreve a preparação da suspensão de células pulmonares de camundongo para análise de citometria de fluxo para estudar a expressão de PD-L1 de células de adenocarcinoma de pulmão.

Preparação de Pulmão de Camundongo para Citometria de Fluxo: Gerando Suspensão Celular do Tecido Pulmonar para Análise de Citometria de Fluxo

As culturas de explante de tecido primário organotípico, que incluem fatias de corte preciso, representam a arquitetura tridimensional (3-D) do tecido, bem como as interações multicelulares do tecido nativo. Este vídeo descreve a cultura de fatias de tecido derivado de tumor de pulmão murino usando uma unidade de incubação rotativa, um sistema que permite a exposição intermitente dos tecidos ao oxigênio e nutrientes. O protocolo descreve a metodologia para gerar e cultivar fatias de tumor de...

Cultura de explante de tecido de tumor de pulmão: um procedimento para gerar e cultivar fatias de tumor de pulmão cortadas com precisão

Este protocolo descreve as etapas necessárias para realizar a validação ex vivo de experimentos de imagem de xenoenxerto de fluorescência de infravermelho próximo in vivo em camundongos usando nanocorpos marcados com fluoróforo e anticorpos convencionais.

Validação de nanocorpo e Antibody Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Experimentos Tumor Xenoenxerto NIRF-imagem em ratos usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometria de fluxo e microscopia

Neste estudo, apresentamos um protocolo eficaz e reprodutível para isolar as populações imunes do sistema respiratório murino. Também fornecemos um método para a identificação de todas as células imunes inatas e adaptativas que residem nos pulmões de camundongos saudáveis, usando um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores.

Análise Citométrica de Fluxo para Identificação das Células Imunes Inatas e Adaptativas do Pulmão murino

Desenvolvemos uma técnica de processamento tecidual utilizando tecido pulmonar embebido em vibratótomo e agarose para gerar cortes pulmonares, permitindo a aquisição de imagens de alta resolução da arquitetura pulmonar. Empregamos a coloração de imunofluorescência para observar a expressão proteica espacial usando marcadores estruturais pulmonares específicos.

Secção Automatizada por Vibratomo de Tecido Pulmonar Incorporado em Agarose para Imagem por Fluorescência Multiplex

Este protocolo descreve o procedimento para dissociar rapidamente amostras de tumores humanos e de camundongos para sequenciamento de RNA de célula única.

Dissociação de amostras de tecido tumoral humano e de camundongo para sequenciamento de RNA de célula única

Descrevemos protocolos para a preparação de suspensão unicelular de células epiteliais tímicas de camundongo e a coloração de moléculas intracelulares para análise citométrica de fluxo.

Preparação de Suspensão de Célula Única de Células Epiteliais Tímicas de Camundongo e Coloração de Moléculas Intracelulares para Análise por Citometria de Fluxo

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para a agitação do tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido pulmonar é explicado.

Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS

Aprenda a isolar células únicas viáveis de pulmões murinos com tumor usando digestão enzimática otimizada e FACS. Este protocolo viabiliza análises de scRNA-seq com viabilidade superior a 85% para estudos de heterogeneidade tumoral.

Preparação otimizada de tecido pulmonar inteiro portador de tumor murino para citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação otimizada de tecido pulmonar inteiro portador de tumor murino para citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular

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