Name: Avaliação de Esferoides 3D para Estudos de Transdução por AAV (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-08-14T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprenda a avaliar esferoides 3D para terapia gênica usando AAV. Esta plataforma permite análise quantitativa em tempo real da potência do vetor e cinética de expressão do transgene em diversas linhagens celulares.

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Os autores agradecem a Morten Seirup e Trish Hoang pelo fornecimento do plasmídeo para a produção de nanoluciferase AAV e dos reagentes do substrato vivo. Este projeto foi apoiado por uma nomeação para o Programa de Participação em Pesquisa ORISE no CBER, Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos, administrado pelo Instituto Oak Ridge para Ciência e Educação sob um acordo interinstitucional entre o Departamento de Energia dos Estados Unidos e a FDA.

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Os autores não têm nada a declarar.

Apresentamos aqui uma plataforma tridimensional in vitro&#160;otimizada para o desenvolvimento e teste de potência de AAV. Esta plataforma aproveita uma transdução aprimorada, alta sensibilidade e melhor previsibilidade translacional utilizando cultivo celular tridimensional que se assemelha mais à arquitetura do tecido humano. Este sistema diferencia com sucesso a eficácia da transdução entre sorotipos de AAV e elementos regulatórios, incluindo vetores de fita simples e auto-complementares, em múltiplas linhagens celulares. Observamos que, em contraste com os ensaios convencionais em 2D, nos quais a eficiência de transdução é frequentemente definida como a porcentagem de células positivas para o transgene, o sistema de esferoides 3D não permite facilmente a quantificação com resolução em nível de célula única. Portanto, a eficiência de transdução neste estudo é definida como a intensidade do sinal global do marcador (fluorescente ou luminiscente), que reflete as contribuições combinadas da proporção de células transduzidas e do nível de expressão do transgene por célula. A alta sensibilidade dos esferoides reduz substancialmente a necessidade de grandes quantidades de produto, tornando-o economicamente viável, versátil e fisiologicamente relevante para pesquisa e desenvolvimento de AAV.
Essa abordagem resolve desafios importantes dos ensaios tradicionais de cultura celular em 2D, que dependem da adesão a superfícies artificiais e carecem de organização celular, possivelmente&#160;levando a previsões inadequadas do desempenho do vetor em ambientes clínicos. O sistema de esferoides em 3D imita melhor a estrutura do tecido e os padrões de distribuição de fármacos, fornecendo dados sobre o comportamento do vetor que se aproximam mais das condições biológicas reais22,23. O protocolo utiliza placas simples de aderência ultrabaixa, tornando-o facilmente reprodutível em condições laboratoriais padrão.
Este sistema adaptável poderia ser usado para ensaios de neutralização de AAV, para estudar a penetração de AAV e para desenvolver experimentos de co-cultura mais complexos com o objetivo de investigar os efeitos de diferentes ambientes celulares na transdução por AAV. Além disso, plataformas de triagem de fármacos e vetores de alto rendimento podem ser facilmente integradas à plataforma de esferoides, permitindo automação e redução de custos nos fluxos de trabalho de descoberta de vetores para o desenvolvimento de produtos mais direcionados.
Uma grande vantagem prática dos esferoides é a capacidade de crescerem continuamente por semanas sem passagem celular, permitindo estudos prolongados da atividade do AAV. Esse sistema de cultura estável mantém interações importantes entre células e componentes da matriz, evitando as interrupções causadas por colheitas celulares repetidas, necessárias nas culturas em 2D24. O ambiente celular preservado sustenta a organização natural de proteínas e estruturas de membrana essenciais para avaliar a ligação e entrada do AAV nas células25.
Embora os esferoides tridimensionais apresentem grande potencial para avaliações de transdução por AAV, também exibem algumas limitações translacionais em comparação com modelos in vivo&#160;, principalmente devido à sua estrutura simplificada em relação aos tecidos nativos. Os esferoides carecem de componentes fisiológicos críticos, incluindo vasculatura para entrega do vetor, células imunes para avaliação da imunogenicidade e barreiras específicas de tecido, como a barreira hematoencefálica, que poderiam impactar significativamente o desempenho do AAV26. Essas limitações indicam que os esferoides, apesar de oferecerem um nível intermediário de complexidade entre culturas convencionais bidimensionais e modelos animais in vivo, permanecem insuficientes para recapitular completamente o microambiente fisiológico necessário para uma avaliação abrangente do AAV.
O protocolo de esferoides apresentado aqui descreve um único tipo celular por vez. Esse protocolo pode ser desenvolvido para incluir de 2 a 3 tipos celulares adicionais que se agregam em uma estrutura tridimensional básica. Modelos 3D mais complexos, como organoides ou microfluídica, são sistemas multicelulares que recapitulam a diversidade celular e a organização de órgãos específicos, contendo 10 ou mais tipos celulares distintos dispostos em padrões semelhantes aos de tecidos. Tais organoides 3D avançados podem incluir múltiplas células27, culturas embebidas em hidrogel, técnicas de gota suspensa e plataformas microfluídicas11,27,28. Embora esses métodos forneçam arquiteturas teciduais mais complexas, que poderiam ajudar a aprofundar o entendimento da biologia do AAV, geralmente exigem reagentes e equipamentos mais especializados, além de considerável expertise técnica. Por outro lado, os esferoides 3D formados em placas de aderência ultra baixa são consideravelmente mais simples e adequados para muitos laboratórios, devido à sua eficiência de custo e reprodutibilidade.
Etapas críticas para a implementação bem-sucedida deste protocolo incluem manter alta viabilidade celular, pois células comprometidas podem prejudicar a formação de esferoides e a eficiência de transdução. O uso de placas com aderência ultra-baixa e a otimização da centrifugação também são fundamentais para alcançar a compactação dos esferoides. A otimização da MOI para cada tipo celular e sorotipo de AAV é essencial para evitar sinais fracos ou saturação. A seleção do método de detecção apropriado também é crítica, especialmente para análises cinéticas, nas quais é necessária compatibilidade com sistemas contínuos de imagem em tempo real de células vivas. Várias considerações técnicas são importantes para a interpretação precisa da transdução por AAV em esferoides tridimensionais.
Um sinal de transdução fraco ou ausente pode resultar de título viral baixo, MOI subótimo ou tempo de incubação insuficiente; isso pode ser resolvido mediante verificação dos títulos virais, otimização do MOI e prolongamento do tempo de incubação (geralmente 3–5 dias). Sinais fracos de fluorescência ou luminiscência podem refletir baixa expressão do transgene ou penetração limitada do reagente na estrutura tridimensional, o que pode ser melhorado mediante otimização das configurações de exposição ou mediante concessão de tempo adicional para a difusão do substrato. Um desafio importante em certas linhagens celulares, como as células HeLa, é a autofluorescência, que pode levar a um sinal de fundo elevado e sensibilidade reduzida em ensaios baseados em fluorescência. Para superar essa limitação, implementamos um sistema de repórter baseado em nanoluciferase com detecção por luminiscência, que proporciona uma relação sinal-ruído aprimorada e permite detecção mais precisa da transdução em fundos autofluorescentes. Além disso, o sinal de fundo pode surgir de limiarização inadequada ou fluorescência relacionada ao meio e deve ser controlado utilizando poços não tratados (MOI = 0) para definir os níveis de base. Por fim, a saturação do sinal em MOIs elevados pode ocorrer devido à entrada excessiva de vírus ou limitações do detector; isso pode ser mitigado pela redução da faixa de MOI e pela otimização das configurações de exposição do detector, mantendo as medições dentro da faixa dinâmica linear.
No geral, esta metodologia de esferoides tridimensionais fornece um sistema simplificado e reprodutível para avaliar a transdução, potência e cinética de AAV. Ao preencher a lacuna entre ensaios convencionais em 2D e estudos in vivo, ela permite um desenvolvimento mais fundamentado de vetores e apoia o avanço de estratégias de terapia gênica clinicamente relevantes.

Os vetores AAV tornaram-se um dos sistemas preferidos de entrega gênica para aplicações in vivo devido ao seu perfil de segurança e à capacidade de alcançar expressão gênica persistente1. A terapia gênica com AAV está demonstrando sucesso no tratamento de múltiplas doenças raras, com centenas de produtos na fase de desenvolvimento2. Além disso, aplicações emergentes incluem a entrega in vivo de componentes de edição genômica, como a Cas9, com grande potencial para auxiliar no tratamento de doenças de difícil tratamento3. Os principais desafios no desenvolvimento incluem os altos custos de produção e a capacidade preditiva limitada dos ensaios in vitro atuais para determinar a qualidade do produto e a eficácia clínica4.
O avanço das terapias com AAV é fundamentalmente limitado pela ausência de ensaios de atividade padronizados e preditivos que possam prever com precisão o desempenho clínico4,5. Esses ensaios são um componente crítico do processo de desenvolvimento, sendo utilizados para diversas finalidades, incluindo a triagem de bibliotecas de vetores projetados, a otimização de modificações do capsídeo para aprimorar o direcionamento e a avaliação da tropismo tecidual específico. Também servem para caracterizar a influência de sequências reguladoras na expressão do transgene6. Além da seleção de candidatos, os ensaios de transdução com AAV também apoiam o controle crítico de qualidade na fabricação, por meio de ensaios de potência utilizados na liberação de lotes, estudos de comparabilidade entre lotes e avaliações de estabilidade6,7.
O desafio científico reside no desenvolvimento de ensaios que capturem a complexidade das interações vetor-hospedeiro, mantendo ao mesmo tempo a viabilidade prática para uso rotineiro7,8. As abordagens atuais incluem o uso de linhagens celulares imortalizadas que representam o órgão-alvo em culturas tradicionais em monocamada bidimensional. Essas condições de cultivo possuem baixa relevância fisiológica e exigem altas doses de fármacos. Isso cria uma lacuna significativa entre as previsões laboratoriais e a translação clínica. Linhagens celulares projetadas recentemente, como sistemas com superexpressão de AAVR ou ativados por CRISPR, representam avanços importantes, mas não conseguem recapitular a arquitetura tridimensional e as interações com a matriz extracelular características dos tecidos nativos9,10,11. Modelos de nova geração que simulem melhor os microambientes in vivo poderiam superar essa divisão translacional12,13,14.
Desenvolvemos recentemente um sistema de esferoides tridimensionais otimizado para a transdução por AAV, a fim de melhorar a transposibilidade dos ensaios de transdução por AAV. Este sistema aumenta significativamente a eficiência de transdução por AAV em múltiplas linhagens celulares e sorotipos de AAV em comparação com os ensaios padrão-ouro em 2D. Além da sensibilidade aprimorada e da conservação do produto utilizado no ensaio, esses modelos superam as monocamadas em 2D ao proporcionar interações realistas entre células que variam conforme a localização celular dentro do esferoide. Eles também permitem investigações significativas da penetração de fármacos que simulam condições reais de órgãos11,15,16. Além disso, essa abordagem com esferoides oferece vantagens práticas em relação a sistemas mais complexos, como organoides ou culturas mistas, pois utiliza equipamentos laboratoriais padrão e dispensa meios especializados ou requisitos de suporte. Essa simplicidade garante reprodutibilidade e escalabilidade, tornando-o adequado para testes rotineiros de terapia gênica e fluxos de trabalho de desenvolvimento de vetores17.
Esta plataforma de esferoides tridimensionais é particularmente adequada para aplicações que exigem detecção sensível da transdução por AAV em doses baixas e avaliação comparativa de projetos de genoma vetorial. Também permite a avaliação do tropismo dependente de sorotipo. É especialmente vantajosa para linhagens celulares com eficiência de transdução relativamente baixa, que requerem altas doses de AAV em culturas convencionais em 2D. Nessas situações, a sensibilidade aumentada e a maior relevância fisiológica da plataforma tridimensional são fundamentais. No entanto, este sistema pode ser menos apropriado para estudos que exigem componentes imunológicos, entrega vascular ou complexidade tecidual completa. Isso ocorre porque os esferoides não recapitulam totalmente o ambiente in vivo&#160;.
Assim, apresentamos um protocolo direto de esferoides tridimensionais otimizado para ensaios de transdução por AAV, com duas leituras críticas e complementares: eficiência de transdução (definida aqui como o sinal total do marcador por esferoide) e cinética de transdução. Este método fornece uma plataforma economicamente viável, fisiologicamente relevante e informativa para avaliação da potência de AAV, design de vetores e ensaios de neutralização.

<table><tbody><tr><td>Incubadora a 37 °C</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#51025983</td><td>Condições padrão de cultivo</td></tr><tr><td>Células A375</td><td>ATCC</td><td>CRL-1619</td><td>Linhagem celular</td></tr><tr><td>Plasmídeo AAV1</td><td>Addgene</td><td>112862</td><td>Plasmídeo AAV</td></tr><tr><td>Plasmídeo AAV2</td><td>Addgene</td><td>104963</td><td>Plasmídeo AAV</td></tr><tr><td>Plasmídeo AAV5</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td>Plasmídeo AAV</td></tr><tr><td>Plasmídeo AAV8</td><td>Addgene</td><td>112864</td><td>Plasmídeo AAV</td></tr><tr><td>Plasmídeo AAV9</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td>Plasmídeo AAV</td></tr><tr><td>Leitor de placas BioTek GEN5</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>Leitura final para fluorescência ou luminiscência</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#TSO-MX1R</td><td>Manter a suspensão de esferoides</td></tr><tr><td>Corning&amp;trade; Salina Tamponada com Fosfato para Cultura Celular (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MT21040CMX</td><td>PBS para lavar as células</td></tr><tr><td>DMEM com alta concentração de glicose, suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#10569010</td><td>Meio de crescimento completo</td></tr><tr><td>Inibidor Extracelular NanoLuc&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N235B</td><td>Quencha qualquer sinal de Nanoluc&amp;reg; proveniente do ambiente extracelular&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F4135-500mL</td><td>Fornecer fatores de crescimento</td></tr><tr><td>Células HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Linhagem celular</td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td>Linhagem celular</td></tr><tr><td>Células HEP3B</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td>Linhagem celular</td></tr><tr><td>Células HEPG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Linhagem celular</td></tr><tr><td>Células Huh7</td><td>ABM</td><td>T8973</td><td>Linhagem celular</td></tr><tr><td>Microscópio invertido IncuCyte S3</td><td>Sartorius</td><td>NA</td><td>Monitorar a formação e o crescimento de esferoides</td></tr><tr><td>Imager IVIS Spectrum</td><td>Spectralinvivo</td><td>NA</td><td>Leitura final para luminiscência</td></tr><tr><td>Ensaio Nano-Glo&amp;reg; para Células Vivas&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2013</td><td>Reagente substrato luminiscente para detecção em células vivas</td></tr><tr><td>Penicilina-Estrepomicina (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td>Prevenir contaminação bacteriana</td></tr><tr><td>Frascos de cultivo de tecidos T75 com ventilação</td><td>Fisher Scientific</td><td>#NC0509296&amp;nbsp;</td><td>Frascos para cultivar células</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25300120</td><td>Desprendimento enzimático de células</td></tr><tr><td>Placas com baixa adesão</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>Evitar a adesão celular para promover a formação de esferoides</td></tr></tbody></table>

avaliação de esferoides 3d para estudos de transdução por aav

Evaluation of 3D Spheroids for AAV Transduction Studies

Vírus adeno-associados (AAVs) são vetores potentes utilizados para entrega gênica em produtos de terapia gênica. Seu desenvolvimento exige sistemas in vitro&#160;capazes de detectar com confiança diferenças no design do vetor, desempenho de sorotipos, força de elementos regulatórios e cinética de expressão. Esses sistemas também devem suportar aplicações como avaliação de potência e otimização de vetores. Aqui, descrevemos uma plataforma simplificada de esferoides tridimensionais otimizada para avaliar a potência de AAVs, a cinética de expressão de transgenes e a eficácia de transdução específica por sorotipo em diversas linhagens celulares. Esferoides uniformes são gerados utilizando placas com aderência ultrabaixa e mantidos em condições que suportam arquitetura estável e imagens de longo prazo. Após a transdução com AAV, leituras fluorescentes ou luminiscentes são monitoradas em tempo real por meio de sistemas de imagem em células vivas. Isso permite a avaliação quantitativa do sinal do repórter, resposta à dose, atividade de elementos regulatórios e tempo de início por meio de imagens cinéticas contínuas. A plataforma discrimina efetivamente entre designs potentes e fracos do genoma do vetor, bem como entre múltiplos sorotipos de AAV. Este método demonstra desempenho robusto em linhagens celulares com divisão lenta e rápida. Esses resultados estabelecem sua utilidade como um sistema escalável e fisiologicamente relevante para avaliação e desenvolvimento pré-clínicos de terapias genéticas.

Sistemas de cultivo tridimensionais em esferoides aprimoram os modelos convencionais em 2D para o desenvolvimento de terapias gênicas com AAV. Esta metodologia permite a detecção sensível da transdução por AAV em doses baixas, relevância fisiológica aumentada e monitoramento robusto a longo prazo. A plataforma possibilita a avaliação de potência, triagem de alto rendimento e otimização de vetores em diferentes linhagens celulares e sorotipos de AAV.

Avaliação de Esferoides 3D para Estudos de Transdução por AAV

Vírus adenoassociados (AAVs) são vetores potentes utilizados para a entrega de genes em produtos de terapia gênica. O seu desenvolvimento requer sistemas in vitro que ...

Desenvolvemos uma plataforma sensível e fisiologicamente relevante de esferoides tridimensionais para avaliar a atividade de transdução de AAV e melhorar a previsão do desempenho do vetor para terapia gênica. Este protocolo é aplicável para avaliar a atividade de AAV em testes de potência do vetor, triagem de sorotipos, otimização de transgenes, estudos de neutralização e terapia gênica pré-clínica in vitro.Para começar, cultive as células em um frasco de cultura celular T75 até atingirem 70% de confluência em condições padrão. Após a tripsinização das células, prepare uma diluição de 1 para 10 para a passagem rotineira das células. Incube novamente as células até atingirem 70% de confluência e, em seguida, recolha-as. Após avaliar a viabilidade celular, pipete bem a suspensão celular para garantir que esteja completamente homogeneizada. Realize diluições seriadas em dobro das células em uma placa de 96 poços com aderência ultra-baixa, iniciando com 1 × 10⁴ células por poço em 200 µL. De acordo com o delineamento experimental apresentado, adicione 1 volume de meio completo a todas as linhas, exceto à linha superior. Em seguida, adicione dois volumes de 1 × 10⁴ células por poço na linha superior. Dilua seriadamente a linha 1A adicionando um volume da linha 1A à linha 1B e continue da mesma maneira. Centrifugue a placa de aderência ultra-baixa a 350 × g por cinco minutos para concentrar as células no centro e promover o contato célula a célula. Incube a 37 °C, sem perturbação, por 24 a 48 horas para a formação de esferoides. Aguarde três dias para que o diâmetro atinja cerca de 400 µm. Verifique a uniformidade do tamanho dos esferoides, assegurando-se de que as células estejam ressuspendidas uniformemente e de que as placas estejam niveladas. Monitore a morfologia dos esferoides. Selecione esferoides maduros que apresentem adesão celular estreita, em vez de agregados celulares soltos.Após centrifugar as suspensões celulares, transfira a placa para um incubador a 37 graus Celsius equipado com um instrumento de imagem em tempo real. Faça login no software de aquisição. Selecione Programar para adquirir e Escanear conforme programação, depois selecione Criar recipiente como Novo. Em seguida, escolha o tipo de varredura e selecione esferoide. Escolha os canais de interesse. Selecione fase com campo claro. Depois escolha verde ou vermelho. Defina a magnificação desejada para 10x. Escolha o modelo da placa e sua posição na gaveta. Selecione os poços a serem imageados e insira o nome do experimento. Para a configuração de análise, selecione Análise Diferida para mais tarde. Configure as varreduras para serem adicionadas a cada seis horas e escanear indefinidamente. Verifique diariamente o crescimento dos esferoides fazendo login no software de imagem. Selecione Visualizar varreduras recentes e clique duas vezes no experimento desejado. Após selecionar Campo Claro no painel de canais de imagem, use a ferramenta Medir imagem para medir os diâmetros dos esferoides. Remova a placa no dia da formação otimizada dos esferoides e utilize-a para transdução com vírus adeno-associado, ou AAV.Prepare uma placa de fundo redondo de 96 poços contendo 297 microlitros de DMEM suplementado com 2% de FBS sem antibióticos. Adicione 33 microlitros do estoque de AAV ao meio para obter uma multiplicidade inicial de infecção, ou MOI, de 1 vez 10 à potência de 6. Em seguida, prepare diluições seriadas de dez vezes transferindo 33 microlitros de cada diluição para 297 microlitros de meio. Aspire todo o meio da placa de esferoides previamente preparada utilizando uma pipeta multicanal. Transfira 100 microlitros da MOI desejada de AAV da placa de diluição para a placa de tratamento usando uma pipeta multicanal. Coloque as placas de volta no instrumento de imagem. Inicie o monitoramento da transdução rastreando a intensidade fluorescente verde ao longo de 72 horas. Adicione 100 microlitros de DMEM completo por poço a cada três dias para repor os nutrientes. Coloque a placa de volta no instrumento de imagem e inicie o registro da eficiência de transdução a cada seis horas. Analise os dados criando uma definição de análise específica para as células e genes repórter de interesse. Realize análise de ponto final utilizando leituras de fluorescência. De forma semelhante, realize a transdução por AAV em esferoides tridimensionais com repórteres luminiscentes, seguida de análise de transdução por meio de imagem de bioluminescência.Cada linhagem celular exibiu características morfológicas distintas e níveis variáveis de compactação após três dias de semeadura. As linhagens celulares hepáticas formaram esferoides mais compactos e densos do que as demais linhagens celulares. O HEK293T formou uma aparência esférica muito arredondada, com um núcleo necrótico distinto. O A375 formou um agregado celular de formato irregular. Os esferoides foram altamente suscetíveis à transdução por AAV, com transdução intensa detectada em títulos muito baixos de AAV em diferentes linhagens celulares para GFP auto-complementar. A transdução de GFP de fita simples nos esferoides foi observada em níveis mais baixos do que a de GFP auto-complementar. Uma diferença de 100 vezes na fluorescência relativa foi observada entre os transgenes auto-complementar e de fita simples em uma MOI de 10 elevado à potência de 6 em células HEK293T. Uma diferença de três vezes na fluorescência relativa foi observada entre os transgenes auto-complementar e de fita simples em células HEP3B. Os quatro sorotipos de AAV foram detectados com sucesso tanto pelo leitor de placas fluorescente quanto pelo sistema de imagem de células vivas. O AAV2 apresentou a maior eficácia de transdução, seguido pelo AAV1 em ambas as linhagens celulares. Todos os sorotipos de AAV mostraram transdução eficiente utilizando o sistema luminiscente, permitindo a diferenciação precisa da eficácia de transdução. O AAV2 foi o sorotipo mais eficaz em esferoides de HeLa, enquanto o AAV9 apresentou a menor eficácia de transdução. A transdução de GFP auto-complementar pelo AAV2 foi detectável em taxas de infecção tão baixas quanto 10 elevado à potência de 1, com aumento evidente do sinal após cerca de 34 horas em comparação com células não tratadas. O sinal de GFP de fita simples do AAV2 foi mais fraco e mais lento do que o sinal de GFP auto-complementar.O principal desafio ao realizar este protocolo é manter alta viabilidade celular, produzir esferoides uniformes e compactos e otimizar a dosagem de AAV para cada tipo celular e sorotipo. Este protocolo pode avaliar a expressão e funcionalidade de transgenes utilizando RT-qPCR, Western blot, ELISAs e ensaios de atividade somática, além de análise cinética do tempo de início. Estudos futuros podem incorporar culturas co-culturais, organoides, microfluídica, células imunes ou vasculatura para melhor imitar o microambiente in vivo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste artigo, descrevemos a identificação da adeno-associated virus sorotipo 3 (AAV3) como o vetor mais eficiente para alvejar células humanas de câncer de fígado.

De Alta Eficiência Transdução de células de câncer de fígado por recombinante sorotipo de vírus adeno-associado 3 Vetores

Nós demonstramos a base técnica para projetar e evoluir molecularmente sintéticos virais adeno-associados (AAV) vetores de terapia genética através de DNA da família baralhar. Além disso, fornecer orientações gerais e exemplos representativos para a selecção ea análise de individuais cápsides quiméricos com propriedades melhoradas sobre células alvo em cultura ou em ratinhos.

Engenharia e Evolução da Synthetic vírus adeno-associado (AAV) Gene vetores de terapia através de DNA Família Shuffling

Para investigar a permeabilidade da barreira hemato-retiniana e a integridade da membrana limitante interna em modelos animais de doença da retina, usamos várias variantes de vírus adeno-associados (AAV) como ferramentas para rotular neurônios da retina e glia. A expressão gênica repórter mediada por vírus é então usada como um indicador da permeabilidade da barreira retiniana.

Usando vírus adeno-associado como uma ferramenta para o estudo da retina Barreiras na Doença

Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente e reprodutível para produzir, título e lotes de qualidade-controle de vetores de vírus adeno-associado. Permite ao usuário obter uma preparação de vetor com alta-título (≥ 1 x 1013 vector genomas/mL) e um elevado grau de pureza, pronto para uso em vitro ou na vivo .

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Este método pode ser usado para examinar o encurtamento do sarcomere usando cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco com proteínas de sarcomere marcadas por fluorescentes.

Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes.

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a geração e purificação de vetores virais adeno-associados usando um método otimizado de cromatografia de afinidade à base de heparina. Apresenta uma abordagem simples, escalável e econômica, eliminando a necessidade de ultracentrifugação. Os vetores resultantes exibem alta pureza e atividade biológica, comprovando seu valor em estudos pré-clínicos.

Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

Aqui, detalhamos um protocolo otimizado para injeção de veia da cauda lateral de camundongo para administrar sistemicamente o vírus adeno-associado (AAV) em camundongos adultos. Além disso, descrevemos protocolos de ensaios comumente usados para avaliar a transdução de AAV.

Entrega consistente de vírus adeno-associado por injeção lateral na veia da cauda em camundongos adultos

Este relatório detalha o método de injeção localizada de vetores AAV através da pelve renal para transferência eficaz e segura de genes para o rim de camundongo.

Entrega de genes eficaz e segura ao rim de camundongo por meio de injeção lenta e retrógrada da pelve renal de vetores de vírus adeno-associados

Aprenda a avaliar esferoides 3D para terapia gênica usando AAV. Esta plataforma permite análise quantitativa em tempo real da potência do vetor e cinética de expressão do transgene em diversas linhagens celulares.

Avaliação de Esferoides 3D para Estudos de Transdução por AAV

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