Reprogramação de Linhagens de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas a partir de Amostras de Buffy Coat Congeladas

O objetivo desse protocolo é reprogramar as pelagens buffy congeladas humanas, ou PBMCs, em células-tronco pluripotentes induzidas. Esse protocolo purifica de forma única as pelagens cor cor de cor após o descongelamento e identifica uma morfologia celular somática que indica sucesso na reprogramação. Para começar, recupere o casaco de cor buffy congelado derivado do sangue humano e coloque-o no gelo.

Gire suavemente a amostra em um banho-maria a 37 graus Celsius e retire o frasco quando restar apenas um pequeno cristal de gelo. Transfira cuidadosamente o conteúdo do frasco gota a gota para um tubo cônico contendo 12 mililitros de DPBS. Enxágue o frasco com um mililitro de DPBS e adicione o enxágue ao tubo cônico contendo as células retiradas.

Centrifuge a amostra usando um rotor de balde oscilante a 200 g em temperatura ambiente por 10 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em quatro mililitros de DPBS contendo 1% de FBS. Em seguida, sobrepone suavemente a mistura de camada buffy sobre três mililitros de solução de gradiente de densidade, evitando misturar na interface.

Centrífuga usando um rotor de balde oscilante a 800 g por 20 minutos em temperatura ambiente, com o freio desligado. Usando uma pipeta, remova e descarte a camada superior de plasma sem perturbar a interface de plasma para gradiente. Depois, remova a célula mononuclear do sangue periférico, ou camada PBMC, na interface e transfira para um tubo limpo de 15 mililitros.

Lave os PBMCs adicionando três mililitros de meio de expansão e centrifugando a 200 g por 10 minutos em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio de expansão contendo citocinas como SCF, IL-3, EPO e IGF-1. Placar as células em 1 poço de uma placa de 12 poços.

Cultive as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 20% de oxigênio por 10 a 14 dias. Substitua metade do meio dia sim, dia não, até que uma população densa de eritroblastos redondos e brilhantes seja observada, indicando que as células estão prontas para transdução. Três dias após a transdução com o vírus Sendai portador dos fatores Yamanaka, as células são placadas em fibroblastos embrionários de camundongos a dois mililitros por poço.

Incube as culturas por cerca de sete dias, alimentando as colônias emergentes com mídia hESC dia sim, dia não. Coloque a placa contendo as células transduzidas e as colônias emergidas sob um microscópio dissecante. Use o microscópio para localizar uma colônia, puxar e levantar a tampa da placa para expor o poço.

Abra a seringa assépticamente e exponha a agulha. Guiado pelo microscópio, use a ponta da agulha para destacar a colônia das células alimentadoras ao redor, traçando o contorno da colônia. Use a ponta da agulha para cortar a colônia em alguns pedaços de tamanho igual.

Se as peças não tiverem se soltado, use a lateral da agulha para raspá-las ou raspá-las da placa até que fiquem flutuando. Agora usando uma pipeta P200, localize a colônia selecionada ao microscópio, aspire a colônia flutuante com a pipeta e transfira-a para um poço da placa preparada de 24 poços. Garanta que toda a colônia seja transferida sem coletar outras colônias ou células alimentadoras.

Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 20% de oxigênio até que a confluência desejada seja alcançada. Identifique colônias grandes, arredondadas e com bordas brilhantes como prontas para se dividir. Aspire o meio do poço e enxágue a amostra uma vez com um mililitro de DPBS.

Depois, remova o DPBS e adicione 500 microlitros de buffer de dissociação EDTA de 0,5 milimolar. Incube a amostra a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por dois minutos até que as colônias se soltem e as células se arredondam. Em seguida, remova a placa da incubadora e aspire o buffer de dissociação do EDTA.

Usando uma pipeta P1000, colete as células com um mililitro de meio pluripotente humano, pipetando suavemente para cima e para baixo até que as colônias se separem e se fragmentem levemente. Transfira o mililitro de meio e as células para uma nova placa de seis poços contendo um mililitro de meio fresco de células-tronco pluripotentes humanas. Coloque as células na incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 20% de oxigênio.

Alimente diariamente células-tronco pluripotentes induzidas até que o poço esteja confluente e pronto para se dividir. Enquanto isso, cubra um recipiente de 10 centímetros com 7 mililitros de solução de vitronectina de cinco microgramas por mililitro preparada em DPBS e incube-a em temperatura ambiente por uma hora. Para continuar a divisão, adicione de 7 a 10 mililitros de meio pluripotente de células-tronco humanas ao recipiente de 10 centímetros e transfira as células da placa de seis poços para o recipiente na proporção 1:1, incubando conforme demonstrado anteriormente.

Confirme que as células no prato de 10 centímetros estão confluentes antes de dividi-las novamente. Ajuste a razão de divisão com base na morfologia e densidade celular, normalmente usando uma razão 1:10, e anote o número de passagem em cada passagem. Por fim, caracterize células-tronco pluripotentes induzidas confirmando a expressão do marcador de estamina NANOG usando imunofluorescência.

Diferencie as células em linhagens de ectoderme, mesoderma e endoderma usando condições definidas de cultura. Avalie o potencial de diferenciação por meio da coloração para PAX6, Brachyury e SOX17, juntamente com a perda da expressão do NANIG. Ao final da expansão, os PBMCs se diferenciaram em eritroblastos, aparecendo como células brilhantes e redondas de tamanho grande e pequeno.

Enquanto culturas sem essas células ou parecendo mortas dificilmente reprogramavam com sucesso. Transdução e reprogramação bem-sucedidas foram marcadas pelo surgimento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas em células alimentadoras irradiadas, que então desenvolveram a morfologia típica das células-tronco. Enquanto células, que não adotaram morfologia semelhante à das células-tronco, não foram reprogramadas com sucesso.

Células-tronco pluripotentes induzidas reprogramadas com sucesso apresentaram colônias densas e arredondadas com bordas lisas e brilhantes. Subclones com morfologia menos ideal, como diferenciação espontânea ou centros densos, foram limpos ajustando as condições de divisão. Algumas colônias escolhidas não conseguiram expandir-se com sucesso.

Além da morfologia, células-tronco pluripotentes induzidas apresentaram estaminalidade, evidenciado pela expressão do marcador de caule NANOG. Células-tronco pluripotentes induzidas reprogramadas demonstraram potencial de diferenciação em ectoderme, mesoderma e endoderme. Esse protocolo fornece checkpoints detalhados para rastrear e prever o sucesso da reprogramação.

Para confirmar ainda mais se uma linha iPSC é adequada para uso, devem ser realizados cariotipados, genotipagem e testes regulares de micoplasma. Esse protocolo permite reprogramação a partir de populações de pacientes existentes com casacos buffy biobancados, ampliando a utilidade da tecnologia iPSC.