Uso de RMN em solução para caracterizar condensados biomoleculares sob condições bifásicas

Desenvolvemos métodos de RMN para estudar condensados biomoleculares. Esses são fundamentais para a organização celular, mas suas informações contínuas são implicadas em múltiplas transtornos. Usando nossos métodos, investigamos propriedades do material condensado, analisamos o mecanismo de sua formação e monitoramos mudanças de longo prazo, como a maturação do condensado ou a fibrilação patológica de biomoléculas.

Para começar, prepare a amostra bifásica final estabilizada por hidrogel de agarose, misturando os estoques de proteína, estoques de RNA ou ambos com o respectivo tampão quente de agarose em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. A concentração final de proteína, ou RNA, é tipicamente de 50 a 500 micromolares para detecção de RMN. Insira a amostra bifásica preparada em um espectrômetro, depois trave, faça shim, ajuste e sintone o canal de prótons normalmente.

Calibre o comprimento de pulso de 90 graus no canal de prótons usando o procedimento geral de calibração. Depois, grave um espectro unidimensional suprimido por água e verifique se o espectro contém sinais biomoleculares fortes. Se nenhum ou muito pouco sinal for observado, não prossiga com REDIFINE, mas use o CONDENSE-MT.

Grave um experimento de espectroscopia ordenada por difusão para organizar a intensidade do gradiente de difusão de 2 a 95% em 16 passos lineares. Para continuar adquirindo dados para o conjunto completo de REDIFINE, crie nove novos experimentos PPP GPQ S19 de etapas copiando os parâmetros do experimento inicial que acabou de ser executado. Em cada experimento consecutivo, altere apenas o atraso de difusão do D20 em passos variáveis para cobrir a faixa de 100 a 1000 milissegundos.

Execute cada um desses experimentos com o comando adequado. Use o último N para preservar o ganho do receptor ao longo dos 10 experimentos. Defina o Q Sign com SSB2 como função de janela.

Depois, extraia a quinta fatia usando o comando apropriado. Fasear o espectro unidimensional e salvar os parâmetros de fase no conjunto de dados bidimensional. Processe o conjunto de dados bidimensional com o XF2 e realize a correção de linha de base com o ABS2.

Depois disso, extraia as 16 fatias com split 2D. Repita o procedimento semelhante para os nove experimentos restantes. Verifique pelo menos as quatro ou cinco primeiras fatias para garantir que a fase e a correção de base corretas.

Se necessário, corrija manualmente a fase e a linha de base. Depois, use o código MATLAB adequado para a análise. No código, modifique os tempos de difusão, defina os valores PG de acordo com a intensidade do gradiente da sonda e atribua experimentos de um a dez com base no número total de experimentos.

Depois, ajusta os dados de acordo com o modelo REDIFINE usando esse código. Grave o espectro 1D suprimido por água. Se houver muito pouco sinal, prossiga com o experimento CONDENSE-MT.

Determine a taxa R1 da água pela recuperação de inversão T1 para CONDENSE-MT quantitativo. Copie a sequência de pulsos e a lista de VD fornecidas para as respectivas pastas. Após calibrar o pulso de 90 graus do próton, ajuste NS para 2, DS para 0, D1 para 20 segundos, SW para 10 partes por milhão.

TD2 para 16K e TD1 para 24. Para o experimento CONDENSE-MT, copie o conjunto de parâmetros de Bruker, sequência e lista de frequência fornecidos para as pastas específicas de Bruker. Depois, ajuste as frequências e a potência de acordo com o espectrômetro.

Ajuste P1 para o comprimento calibrado de pulso de 90 graus e P4 para um microssegundo para o pulso de excitação, evitando amortecimento de radiação. Ajuste NS para 2, DS para 16, D1 para quatro segundos, SW2 para 20 partes por milhão, TD2 para 8k e TD1 para o comprimento da lista de frequências. Ajuste SPNAM10 para Squa100.000 e ajuste P10 para cinco segundos.

Encontre a potência SP10 que gera irradiações de 100 hertz. Ajuste a potência SP10 do pulso de irradiação de acordo. Execute o experimento pseudo bidimensional com o comando apropriado e configure uma série desses experimentos pseudo 2D, variando os poderes de irradiação SP10.

Após ajustar todos os parâmetros, execute o código para ler os espectros de RMN, que integram o sinal de água e o salvam em uma nova variável. Na recuperação por inversão de código, ajuste o caminho para os dados apropriados e verifique a região de integração da água. Depois, ajuste o número do experimento contendo os dados de recuperação por inversão.

Defina todos os parâmetros experimentais e insira os valores do conjunto vazio de agarose previamente obtidos ajustando o conjunto de dados de agarose de forma semelhante. Execute a primeira seção do código vazio condensado para obter o ajuste para relaxamento longitudinal da água. Depois, execute a seção de conexão condensada vazia para iniciar a figura em tempo real que mostra a minimização da função de ajuste.

Execute a próxima seção do código para determinar as incertezas e plotar os dados. O ajuste REDIFINE determinou os coeficientes de difusão nas fases diluída e condensada, a população de proteína na fase condensada, o tamanho médio das gotículas e a permeabilidade da interfase para a amostra do domínio N do FUS. O sinal de RMN do domínio N do FUS permaneceu detectável na fase condensada.

Não foi observada diferença no perfil de transferência de magnetização entre a referência de agarose e o domínio N do FUS por amostra fásica. Para condensados de RNA repetidos CAG, nenhum sinal de RMN é observado. Assim, o perfil de transferência de magnetização é significativamente diferente da referência de agarose.

O experimento CONDENSE-MT forneceu caracterização dinâmica de condensados de RNA de expansão repetida. A análise CONDENSE-MT revelou a cinética de troca de prótons entre o condensado e a água a granel. A análise CONDENSE-MT também forneceu o tempo de relaxamento transversal do RNA no condensado e a taxa aparente de relaxamento transversal da água a granel.

Neste protocolo, podemos caracterizar a propriedade do condensado em estado bifásico sem a necessidade de uma etiqueta química. As gotículas coexistem com um ambiente diluído, permitindo a troca entre as duas fases que imitam o ambiente celular. Nossos métodos focados na caracterização de condensados podem ser complementados por métodos convencionais de RMN para estudar as interações e dinâmicas da estrutura molecular entre fases.

Em estudos futuros, pretendemos desenvolver modelos de condensados mais complexos, adaptando a metodologia a sistemas mais complexos e, eventualmente, estudar o condensado diretamente em seus ambientes intracelulares.