Extração de DNA em Coluna de Média Capacidade Usando Racks de 24 Poços
24 de julho de 2026
Este protocolo descreve um método custo-efetivo para acelerar a extração de DNA plasmídico. Ao utilizar racks personalizados impressos em 3D compatíveis com rotores padrão de placas de balde oscilante, os pesquisadores podem processar até 48 colunas de rotação com tampas ou até 116 colunas de spin sem tampas simultaneamente, reduzindo significativamente o tempo de manuseio em comparação com métodos manuais de microcentrífuga.
Nossa pesquisa concentra-se em trilhos impressos em 3D para extração paralela de DNA e RNA em colunas de centrifugação, integrando métodos manuais e automatizados. Este artigo aborda as limitações dos métodos manuais em colunas de centrifugação, que exigem muito trabalho, ao permitir o processamento simultâneo de até 116 amostras de DNA ou RNA. Para começar, utilize uma impressora 3D por filamento fundido com bico de 0,4 milímetro para imprimir o suporte.
Utilize polilactídeo genérico, ou PLA, politereftalato de etileno glicol, ou PETG, ou filamento de acrilonitrila butadieno estireno, ou ABS, com preenchimento de 100%. Defina a altura da camada em 0,1 milímetro e ative o alisamento da superfície. Ajuste as configurações de impressão para garantir estanqueidade e estabilidade mecânica.
Teste os suportes quanto à impermeabilidade antes de usá-los pela primeira vez. Encha o reservatório impresso com etanol 70% para testá-lo antes do uso. Realize centrifugação por durações progressivamente crescentes para confirmar a ausência de vazamentos ou danos estruturais.
Após o teste bem-sucedido com cola, una os componentes do reservatório base para formar uma unidade selada. Inocule escherichia coli, ou transformantes E.Coli, em três a cinco mililitros de caldo lisogênico, ou meio LB, contendo antibióticos apropriados. Incube a cultura por 12 a 16 horas a 37 graus Celsius com agitação.
Centrifugue a 2000 G durante 10 minutos para recolher as células. Descarte o sobrenadante. Adicione 250 microlitros de tampão de re-suspensão ao precipitado.
E ressuspenda completamente o pellet por vortex ou pipetagem. Adicione 250 microlitros de tampão de lise. E misture suavemente invertendo o tubo quatro a seis vezes ou agitando a placa de 24 poços.
Adicione 350 microlitros de tampão de neutralização e misture. Observe a formação de um precipitado branco para confirmar a neutralização bem-sucedida. Adicione tampão de lise em um tubo contendo pó de dióxido de titânio.
Adicione uma proporção de volume para massa de dois para um. Adicione 250 microlitros da suspensão de dióxido de titânio ao lisado e misture agitando o tubo.
Adicione 350 microlitros de tampão de neutralização e misture completamente. Centrifugue a 2000 G durante 10 minutos. Observe o pellet celular completamente precipitado na presença de dióxido de titânio e o sobrenadante aparecendo totalmente transparente.
Na ausência de dióxido de titânio, observe a presença de sedimento residual no sobrenadante. Colete o sobrenadante sem perturbar o precipitado e transfira-o para a coluna de ligação. Coloque as colunas de ligação de DNA na camada do suporte de colunas do suporte.
Posicione as tampas das colunas nas ranhuras designadas para fixá-las durante a centrifugação. Coloque as colunas de clarificação ou filtração na camada de coluna de filtro diretamente acima das colunas de ligação. Transfira o lisado neutralizado preparado para as colunas de filtração.
Coloque o suporte montado em um rotor de rotor de placa com cubas oscilantes. Centrifugue a 2000 G por um minuto à temperatura ambiente. Após remover o suporte da centrífuga, remova e descarte a camada da coluna de filtro.
Descarte o fluxo proveniente do reservatório em um recipiente de resíduos. Monte novamente o suporte com as colunas de ligação. Adicione de 500 a 700 microlitros de tampão de lavagem a cada coluna de ligação.
Centrifugue a 2000 G durante um minuto. Descarte o fluxo do reservatório e repita a etapa de lavagem conforme demonstrado anteriormente. Remova as colunas de ligação do suporte e transfira-as para tubos de coleta de dois mililitros.
Centrifugue a 10.000 G ou mais por um minuto para secar a membrana. Transfira as colunas para tubos limpos de 1,5 mililitro. Adicione 50 microlitros de tampão de eluição ou água diretamente à membrana e incube as colunas por um minuto à temperatura ambiente.
Centrifugue a 10.000 G ou mais por um minuto para eluir o DNA. O rendimento total de plasmídeo não apresentou diferença significativa entre o método convencional e a extração utilizando as configurações do suporte. A confirmação do plasmídeo foi preservada com distribuições semelhantes das formas relaxadas, linearizadas e superenroladas.
A distribuição do corante foi restrita à área de descarte diretamente abaixo das colunas carregadas, sem sinal visível detectado em poços adjacentes ou nas pontas das colunas vizinhas, indicando que o design do suporte reduz a probabilidade de salpicos e transferência entre colunas. A amplificação foi detectada apenas nos eluatos das colunas às quais o amplicon havia sido adicionado. Esta partícula permite aos pesquisadores obter DNA plasmidial de alta qualidade para aplicações posteriores, incluindo clonagem, sequenciamento e análise por PCR.
A consideração mais importante ao realizar este protocolo é evitar a contaminação cruzada mediante a utilização de um reservatório estanque, sem sobreposições, fabricado por impressão 3D. Além disso, após seguir este procedimento, essas grades podem ser usadas para qualquer análise de extração de ácidos nucleicos baseada em coluna.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método semi-automatizado e escalável para extração de DNA em alto rendimento utilizando colunas de giro com membrana de sílica. Ao utilizar suportes personalizados impressos em 3D, compatíveis com rotores de centrífuga para placas padrão, a abordagem permite o processamento eficiente de grandes lotes de amostras em paralelo, oferecendo uma alternativa economicamente viável aos sistemas automatizados de manipulação de líquidos, geralmente caros.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia molecular
- Genômica
- Automação laboratorial
Antecedentes
- A extração por coluna de spin com membrana de sílica é amplamente utilizada para a purificação de DNA de alta qualidade.
- O processamento manual é trabalhoso e difícil de ampliar para um grande número de amostras.
- Robôs automatizados de manipulação líquida são frequentemente proibitivamente caros para laboratórios menores.
- Existe uma necessidade de soluções acessíveis e escaláveis para extração de DNA.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um fluxo de trabalho simplificado e semi-automatizado para extração de DNA.
- Projetar suportes impressos em 3D que permitam o processamento em alto rendimento utilizando equipamentos laboratoriais padrão.
- Suprir a lacuna entre minipreparações manuais e a automação de alto custo.
Métodos Utilizados
- Bancadas personalizadas, impressas em 3D, para colunas de centrifugação.
- Processamento paralelo de até 116 colunas de centrifugação comerciais.
- Configuração aninhada para clarificação simultânea do lisado e ligação do DNA em um único passo de centrifugação.
- Reservatório de resíduos compartilhado para simplificar os passos de lavagem e o gerenciamento de resíduos.
Resultados Principais
- O rendimento e a pureza do DNA são comparáveis aos dos protocolos manuais padrão.
- O tempo total de processamento é reduzido em 50–70% para lotes com mais de 24 amostras.
- O tempo de processamento para filtração, lavagens e descarte de resíduos é reduzido em 5–10 minutos, independentemente do tamanho do lote.
- O sistema é de código aberto e economicamente eficiente para laboratórios pequenos e médios.
Conclusões
- O sistema semi-automatizado aumenta significativamente a produtividade e a eficiência na extração de DNA.
- Oferece uma alternativa prática e acessível à automação completa para muitos laboratórios.
- Essa abordagem democratiza o acesso à tecnologia de purificação de DNA de alto rendimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A extração eficiente e escalonável de DNA é um gargalo crítico em fluxos de trabalho de descoberta e triagem de fármacos orientados pela genômica. Este sistema semiautomatizado e de média produtividade permite a purificação de ácidos nucleicos de alta qualidade a uma fração do custo e da mão de obra da automação completa, apoiando diretamente equipes de P&D em biofármacos que buscam ampliar o volume de amostras sem investimentos significativos de capital. A abordagem preenche a lacuna entre minipreparações manuais e robótica cara, aumentando a flexibilidade operacional e a alocação de recursos ao longo dos pipelines de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite extração rápida e paralela de DNA para apoiar estudos de triagem genética e identificação de alvos.
- Facilita o processamento de amostras em alto rendimento para investigação de vias e estudos mecanicistas.
- Melhora a consistência das amostras, reduzindo a variabilidade em ensaios moleculares subsequentes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara DNA de alta qualidade para o desenvolvimento de ensaios, genotipagem e plataformas de triagem molecular.
- Apóia a padronização e reprodutibilidade ao minimizar etapas de manipulação manual.
- Escalona eficientemente para processamento em lote, permitindo triagem robusta de bibliotecas de compostos ou genéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Fornece extração confiável de DNA para estudos de descoberta e validação de biomarcadores.
- Mantém a integridade da amostra para pesquisas translacionais que exigem qualidade consistente de ácidos nucleicos.
- Permite continuidade desde a fase inicial de descoberta até a validação pré-clínica, ao apoiar conjuntos maiores de amostras.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este sistema de extração semi-automatizado integra-se entre as fases iniciais de descoberta e os fluxos de trabalho pré-clínicos, permitindo uma transição contínua de estudos orientados por hipóteses para triagem de alto rendimento e pesquisas translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a análise de vias ao permitir a extração eficiente de DNA de diversos conjuntos de amostras.
- Triagem: Fornece rendimentos reprodutíveis e quantitativos de DNA adequados para ensaios moleculares e plataformas de triagem.
- Análises: Fornece entrada consistente de ácidos nucleicos para análises comparativas e avaliação estatística de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se com estudos de biomarcadores e pré-clínicos que exigem preparação de DNA de alta qualidade e escalável.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma aberta e adaptável para uso repetido em diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao garantir a qualidade e consistência do DNA entre experimentos.
- Valor Operacional: Reduz em 50–70% a mão de obra e o tempo de processamento em grandes lotes, melhorando a eficiência do laboratório.
- Valor Estratégico: Permite a ampliação econômica de fluxos de trabalho em genômica sem grandes despesas de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao permitir o processamento de amostras com maior produtividade e reprodutibilidade em múltiplos projetos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimentos básicos em biologia molecular e familiaridade com protocolos de colunas de centrifugação.
- Necessita de acesso a rotores de placa para centrífuga e componentes de suporte impressos em 3D.
- Exige padronização entre equipes para operação consistente e qualidade dos dados.
- Adaptável a diversos tipos de amostras e necessidades de produtividade, dentro das limitações da capacidade da centrífuga.
- Depende da disponibilidade de hardware de código aberto e das capacidades locais de fabricação.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:28
Preparation of 3D-Printed Equipment
1:34
Preparation of Bacterial Culture and Cell Lysate
2:43
Preparation of Lysate Using Titanium Dioxide Co-Precipitation
3:41
Assembly of the Filtration Unit for Lysate Clearance and DNA Binding
4:27
Washing and Elution of DNA
5:32
Results
6:22
Conclusion
