Detecção de Senescência usando luz refletida na fração vascular estromal adiposa

Estudamos a senescência dos adipócitos em diferentes depos de gordura e condições metabólicas, como obesidade e hiperinsulinemia. Ensaios SABG tradicionais baseados em Brightfield não permitem multiplexação e são muito subjetivos. Nosso novo protocolo é menos subjetivo e permite multiplexação.

Para começar, retire o tubo contendo o tecido adiposo humano. Homogeneize 10 gramas de tecido adiposo e adicione-o a um tubo contendo 0,05% de enzima colágenosa tipo um para obter aproximadamente um milhão de células da fração vascular estromal, ou SVF. Aliquota 500.000 células em cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Adicione um mililitro de paraformaldeído a 2% ao tubo para fixação celular. Depois, incube em um balanço em temperatura ambiente por 20 minutos. Centrifuge a 600G por 10 minutos e remova o sobrenadante.

Prepare a solução de coloração X-Gal usando o kit de coloração senescência beta-galactosidase, conforme as instruções do fabricante. Adicione um mililitro da solução de tingimento em três tubos novos. E ajuste o pH para cinco, seis e oito usando soluções de ácido clorídrico molar ou hidróxido de sódio molar.

Use um medidor de pH calibrado para verificar o pH. Adicione a solução de coloração X-Gal ajustada com pH a cada um dos tubos marcados contendo 500.000 células. Incube a 37 graus Celsius por 24 horas sem dióxido de carbono.

Centrifuge as células a 600G por 10 minutos. Após remover o sobrenadante, lave as células com PBS. E centrifugar novamente a 600G por 10 minutos.

Uma vez removido o sobrenadante, para identificar células endoteliais dentro da SVF heterogênea, incube-as com CD31 específico de células endoteliais ou controle anticorpos primários IgG a quatro graus Celsius durante a noite. Lave as células três vezes com 0,1% de PBST por 10 minutos em temperatura ambiente em um oscilador para remover o anticorpo primário não ligado. E centrifugar a 600G por 10 minutos.

Após descartar o sobrenadante, incube as células com um anticorpo secundário por uma hora em temperatura ambiente em um oscilante. Centrifuge a 600G por 10 minutos para remover a solução secundária de anticorpos coloridos. Lave as células três vezes usando PBST e depois centrifuge, como demonstrado anteriormente.

Resuspenda as células no antifade. Pipete a suspensão celular sobre lâminas de microscópio e cure durante a noite em temperatura ambiente para imobilizar as células. No dia seguinte, adicione 100 microlitros de 100% de glicerol.

Coloque uma capa por cima e fele com esmalte. Coloque a lâmina preparada no palco de um microscópio confocal. Na interface do software do microscópio, selecione a opção Caminho de Luz e ajuste a configuração do divisor de feixe para T90R10.

Em seguida, verifique os valores de comprimento de onda de corte para os espelhos dicroicos secundários, ou SDMs, na configuração Espelho. No menu Detector, clique na opção Selecionar Corante e Detector para atribuir canais e comprimentos de onda de excitação. Depois, defina os valores percentuais de intensidade de potência do laser para cada laser específico na faixa de 10 a 15%. No menu Série, na seção LSM, alterne a opção Z para Ligado. Defina o tamanho do passo Z para o ótimo do sistema de 0,74 micrômetros.

Em seguida, no menu Seção Z, insira o valor do campo de entrada inicial e defina uma pilha Z baseada no sinal de membrana para capturar o volume completo da célula. No painel Acquir, insira o nome do arquivo e o local de salvamento no campo de entrada LSM. E clique em LSM Start para iniciar a aquisição da imagem.

E salve os arquivos no nosso formato nativo de microscópio. Após a aquisição, use as setas de navegação Z para verificar o sinal e a distribuição focal de diferentes corantes em toda a pilha Z. Faça upload do arquivo salvo para a Imagem J.In na janela pop-up de Opções de Importação de Bio-Formatos, clique em Ok.

Clique no Menu de Imagem para abrir o arquivo. E nas opções suspensas, selecione Cor, depois a opção Dividir Canais para abrir os diferentes canais como janelas separadas. Em seguida, ajuste o contraste de brilho e otimize os valores de LUT usando a opção Ajustar no menu Imagem para visualização aprimorada da imagem.

Use a barra de rolagem do eixo Z na parte inferior do quadro para percorrer as seções ópticas e verificar as características celulares em toda a pilha. No menu Imagem, escolha Empilhar. Depois, selecione a função Projeto Z para gerar projeções de intensidade somadas da imagem confocal tridimensional.

Na caixa de diálogo de Projeção Z, defina os intervalos de fatia de início e fim. Selecione o tipo de projeção e clique em Ok para obter a imagem composta 2D final. Em seguida, navegue até o menu Imagem.

Selecione a opção Tipo para ajustar o tipo de imagem para 16 bits. Depois, salve e exporte as imagens como arquivos TIF de 16 bits. Importe as imagens salvas para o CellProfiler versão 4.2.8 para segmentação automatizada de células, quantificação da intensidade de luz refletida para cada célula e exportação dos valores de medição de intensidade para uma planilha.

Na planilha, defina o limiar para positividade beta-galactosidase associada à senescência como a soma da intensidade média da luz refletida da condição de pH 8 mais três desvios padrão. Classifique as células na condição de pH 6 como beta-galactosidase associada à senescência se seus valores de intensidade excederem o limiar estabelecido. A coloração beta-galactosidase associada à senescência refletida em células SVF humanas produziu padrões claros e reprodutíveis em três níveis de pH.

No pH 5, a maioria das células apresentava um sinal forte devido à alta atividade enzimática endógena. No valor padrão do ensaio pH 6, a intensidade e frequência do sinal diminuíram, permitindo a identificação específica de células beta-galactosidase associadas à senescência. No pH 8, o sinal era mínimo, e isso servia como referência para definir o limiar de positividade.

Testes de sensibilidade à detecção mostraram que a imagem de luz refletida superou o campo claro em todas as condições de pH. No pH 5, a luz refletida mostrou fortes precipitados X-Gal, enquanto o Brightfield capturou apenas os maiores depósitos. No pH 6, a luz refletida identificou células positivas que eram fracas ou difusas demais para serem vistas em campo claro.

No pH 8, a imagem com luz refletida detectou sinal mínimo, consistente com baixa atividade enzimática, superando o Brightfield na identificação de precipitados X-Gal em níveis intermediários e baixos de atividade. No conjunto, esse fluxo de trabalho de imagem com luz refletida integra a detecção simultânea de beta-galactosidase associada à senescência dependente de pH e marcadores baseados em fluorescência, como o CD31, facilitando avaliações de senescência multi-características com resolução de célula única dentro de populações heterogêneas de SVF. Esse protocolo permite medições sensíveis e quantitativas de atividade do SABG enquanto simultaneamente permite tanto outros marcadores de senescência quanto outros marcadores celulares.

O principal desafio, eu diria, é a configuração inicial da microscopia. Mas, uma vez otimizado, você pode usar os mesmos parâmetros de aquisição entre os experimentos. Estudos futuros podem combinar esse ensaio com outros marcadores subcelulares para ver como a SABG se relaciona com diferentes processos celulares.