Marcagem Metabólica do Transcriptoma Nascente em Xenopus : Embriogênese Precoce

Neste estudo, investigamos como a ativação do gene zigótico e a regulação transicional ocorrem durante a gênese inicial do embrião de xenopus. Métodos existentes têm dificuldade em detectar os novos transcritos zigóticos ativados que emitem abundantes RNAs maternos. Esse protocolo rotula e enriquece transcrições iniciais.

Para começar, coloque a câmara de microinjeção sob um microscópio estereoscópico e adicione um mililitro de solução de Ficoll na câmara. Obtenha embriões de Xenopus laevis armazenados em ringers modificados ou solução MMR de 0,1X. Use uma pipeta plástica de transferência para transferir 20 ou mais embriões para o centro da câmara de microinjeção.

Prepare a agulha de injeção cortando a ponta fina de uma agulha de vidro com uma pinça. Posicione a agulha verticalmente com a ponta voltada para baixo e carregue 0,5 microlitros de 50 mM de 5-etiniluridina ou 5 M EU usando uma pipeta P2 com ponta microcargadora. Monte a agulha em um micromanipulador.

Usando uma pipeta P10, coloque 10 microlitros de óleo de halocarbonetos em um micrômetro de palco posicionado sob um microscópio estereoscópico. Para calibração de volume, pressione o pedal do microinjetor e injete uma gota no óleo de halocarbonetos do micrômetro. Ajuste a pressão e o tempo de injeção no microinjetor até que o diâmetro da gotícula seja de 0,27 milímetros.

Segure o embrião de estágio celular com uma pinça e controle a agulha com o micromanipulador para injetar 10 nanolitros de 50 mM 5 EU. Transfira os embriões injetados para um novo recipiente de vidro contendo solução de Ficoll e incube por uma hora. Remova a solução Ficoll e adicione uma solução XMMR 0,1. Inspecione visualmente os embriões durante o desenvolvimento e remova quaisquer embriões anormais, se necessário.

Transfira 10 embriões no estágio de desenvolvimento desejado para um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Remova qualquer meio residual do tubo, congele rapidamente os embriões em nitrogênio líquido e armazene em um freezer com temperaturas de menos 80 graus Celsius. Depois, extrai o RNA total dos embriões e meça sua concentração usando kits comerciais.

Para fazer uma reação de clique de 50 microlitros, misture os componentes mostrados em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Incube a mistura de reação em um nutator em temperatura ambiente por 30 minutos. Agora adicione glicogênio, acetato de amônio e etanol gelado a cada mistura de reação.

Misture bem pipetando cinco vezes. Incube durante a noite em um freezer com temperaturas de menos 80 graus Celsius. Após a incubação durante a noite, centrifuge a 13.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius, depois remova o sobrenadante sem perturbar o pellet.

Lave o pellet duas vezes com 700 microlitros de etanol 75%. Após centrifugar e descartar o sobrenadante, seco o pellet ao ar em temperatura ambiente por cinco a dez minutos e resuspenda o pellet em 10 microlitros de água livre de RNase. Dispense cinco microlitros de esferas magnéticas revestidas com estreptavidina em um novo tubo de 1,5 mililitro.

Adicione nove microlitros de buffer de lavagem 2 às esferas e misture bem. Coloque o tubo em um suporte magnético por dois minutos. Remova o sobrenadante e repita as lavagens mais duas vezes.

Depois, resuspenda as esferas em cinco microlitros de buffer de lavagem 2. Prepare uma mistura master em um tubo de microcentrífuga de 1,5 microlitro. Adicione 15 microlitros da mistura master a cada tubo contendo a amostra de RNA.

Coloque o tubo sobre um bloco térmico e incube-o a 69 graus Celsius por cinco minutos. Depois, coloque o tubo no gelo. Depois, adicione cinco microlitros de esferas pré-lavadas a cada amostra de RNA e incube em um nutator em temperatura ambiente por 30 minutos.

Lave os complexos de RNA das esferas cinco vezes com o buffer de lavagem 1 de 50 microlitros, seguido de cinco lavagens com buffer de lavagem 2 de 50 microlitros. Resuspenda as esferas em um buffer de lavagem de cinco microlitros 2. Use as esferas contendo os RNAs EU emergentes diretamente para síntese complementar de ácido desoxirribonucleico e preparação de bibliotecas.

Um número crescente de genes ativados diferencialmente foi detectado durante a ativação do genoma zigótico, quando o transcriptoma nascente seis horas após a fertilização foi comparado com o que estava cinco horas após a fertilização, com aumentos adicionais observados sete horas após a fertilização, oito horas após a fertilização e nove horas após a fertilização. Genes zigóticos foram detectados em níveis mais altos e em períodos mais cedo nos dados iniciais de sequenciamento de RNA da UE, em comparação com os dados totais de sequenciamento de RNA. A purificação cuidadosa dos RNAs nascentes marcados metabolicamente é o fator mais crítico para garantir sensibilidade e especificidade nesse protocolo.

RNAs nascentes marcados na UE produzidos por esse protocolo podem ser analisados bioquimicamente in vitro. Essa abordagem permite que estudos futuros investiguem padrões de ativação genômica, expressão gênica específica de tecidos e mecanismos regulatórios como resolução de célula única.