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<ol>
	<li>Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+skin+and+intrinsic+aging:+biological,+environmental,+and+therapeutic+insight.">Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight.</a> J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).</li><li>Dorf, N., Maciejczyk, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+senescence-from+basic+research+to+clinical+practice.">Skin senescence-from basic research to clinical practice.</a> Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).</li><li>Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+cigarette+smoke+and+solar+rays+causes+effects+similar+to+skin+aging+in+a+bilayer+skin+model.">The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model.</a> Sci Rep. 13, 17969 (2023).</li><li>Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+collagen+production+in+chronologically+aged+skin:+roles+of+age-dependent+alteration+in+fibroblast+function+and+defective+mechanical+stimulation.">Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation.</a> Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).</li><li>Zhang, S., Duan, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fighting+against+skin+aging:+the+way+from+bench+to+bedside.">Fighting against skin aging: the way from bench to bedside.</a> Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).</li><li>Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+antioxidants+in+skin+aging+and+the+molecular+mechanism+of+ROS:+a+comprehensive+review.">Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review.</a> Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).</li><li>Addor, F. A. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+photoaging:+additional+factors+involved+in+the+process+of+skin+aging.">Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging.</a> Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).</li><li>Mucha, M., Skrzydlewska, E., GÄ™gotek, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+protection+against+oxidative+stress+in+human+skin+melanocytes.">Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes.</a> Commun Biol. 8, 1283 (2025).</li><li>Hughes, B. K., Bishop, C. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+understanding+of+the+role+of+senescent+melanocytes+in+skin+ageing.">Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing.</a> Biomedicines. 10, 3111 (2022).</li><li>Kami&#324;ski, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+melanogenesis+and+melanoma+development.">Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development.</a> Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).</li><li>Jim&#233;nez-Cervantes, C., Mart&#237;nez-Esparza, M., P&#233;rez, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanogenesis+in+response+to+oxidative+stress:+transient+downregulation+of+melanocyte+differentiation+markers+and+possible+involvement+of+microphthalmia+transcription+factor.">Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor.</a> J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).</li><li>Da&#324;czak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Pola&#324;ska, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+skin-related+research:+targeted+signaling+pathways+and+naturally+occurring+therapeutic+agents.">Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents.</a> Aging Cell. 22, e13845 (2023).</li><li>Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dangerous+liaisons:+loss+of+keratinocyte+control+over+melanocytes+in+melanomagenesis.">Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis.</a> Bioessays. 46, e2400135 (2024).</li><li>Ali, L., Al Niaimi, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+melasma+explained.">Pathogenesis of melasma explained.</a> Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).</li><li>Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+good+is+the+evidence+that+cellular+senescence+causes+skin+ageing.">How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing.</a> Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).</li><li>Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cellular+senescence+in+skin+aging+and+age-related+skin+pathologies.">The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies.</a> Front Physiol. 14, 1297637 (2023).</li><li>Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+senescence-associated+phenotype+in+human+skin+fibroblasts.">Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts.</a> Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).</li><li>Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cellular+senescence+in+human+primary+melanocytes+and+malignant+melanoma+cells+in+vitro.">Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro.</a> Cells. 11, 1489 (2022).</li><li>Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+face+skin+melanocytes+for+the+study+of+hyperpigmentation.">Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation.</a> Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).</li><li>Ku&#269;era, O., Endlicher, R., Rou&#353;ar, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tert-butyl+hydroperoxide-induced+oxidative+stress+on+lean+and+steatotic+rat+hepatocytes+in+vitro.">The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro.</a> Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).</li><li>Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tBHP+treatment+as+a+model+for+cellular+senescence+and+pollution-induced+skin+aging.">tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).</li><li>Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+oxidative+stress+upregulates+drusen-related+protein+expression+in+adult+human+RPE+stem+cell-derived+RPE+cells:+a+novel+culture+model+for+dry+AMD.">Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD.</a> Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).</li><li>Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+to+make+human+skin+models+based+on+cellular+senescence+for+ageing+research.">Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research.</a> Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).</li><li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. 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S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transfection+of+melanocytes.">Isolation, culture, and transfection of melanocytes.</a> Curr Protoc. 3, e774 (2023).</li><li>Martic, I., Wedel, S., Jansen-DÃ¼rr, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+to+investigate+UVB-induced+cellular+senescence+and+pigmentation+in+melanocytes.">A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes.</a> Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).</li><li>Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+human+melanocytes+drive+skin+ageing+via+paracrine+telomere+dysfunction.">Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction.</a> EMBO J. 38, e101982 (2019).</li><li>Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+response+and+Nrf2+signaling+in+aging.">Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging.</a> Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).</li><li>Birch, J., Gil, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+and+the+SASP:+many+therapeutic+avenues.">Senescence and the SASP: many therapeutic avenues.</a> Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).</li><li>Kang, H. Y., Ortonne, J. 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A., Partridge, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153, 1194-1217 (2013).</li><li>Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+melanogenesis.">Mechanisms regulating melanogenesis.</a> An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).</li><li>Ratz-&#321;yko, A., Arct, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+as+an+active+ingredient+for+cosmetic+and+dermatological+applications:+a+review.">Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review.</a> J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).</li><li>Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senolytics+improve+physical+function+and+increase+lifespan+in+old+age.">Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age.</a> Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).</li><li>Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+senescent+cell+clearance+alleviates+age-related+brain+inflammation+and+cognitive+impairment+in+mice.">Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice.</a> Aging Cell. 20, e13296 (2021).</li><li>Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+transcriptional+heterogeneity+in+senescent+cells.">Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells.</a> Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m membrane filter</td><td>Merck&nbsp;</td><td>SLGVR33RS</td><td></td></tr><tr><td>1 M citric acid&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>K91567844</td><td>prepare in aq. dest.</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Merck</td><td>A649033</td><td>prepare in aq. dest.</td></tr><tr><td>1 M Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>K56036736</td><td>prepare in aq. dest.</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Lab Honeywell</td><td>30620</td><td>prepare in aq. dest.</td></tr><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>CarlRoth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>5 M Sodium Chloride&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>prepare in aq. dest.</td></tr><tr><td>50% glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-&beta;-D-Galactopyranosid (X-Gal)</td><td>Sigma</td><td>B9146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent substrate</td><td>Sigma</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Costar CellLifter&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips for cell culture/microscopy</td><td>Epredia</td><td>CB00200RA120MNZ0</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife Basal Medium</td><td>CellSystems</td><td>LM-0004</td><td></td></tr><tr><td>DermaLife M Melanocyte Kit&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS-1041</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Human neonatal melanocytes</td><td>CellSystems</td><td>FC-0023</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1 antibody (rabbit)</td><td>Abcam</td><td>AB16048</td><td>Dilution 1:1000 in 5% BSA</td></tr><tr><td>Mounting medium containing DAPI</td><td>Abcam</td><td>AB104139</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide gradient gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A38904-01</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferrocyanide</td><td>Sigma</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>pRB antibody (rabbit)</td><td>CellSignalling</td><td>93085</td><td>Dilution 1:1000 in 5% BSA</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>self prepared</td><td>N/A</td><td>500 mM NaF; 2 &micro;g/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate</td></tr><tr><td>RIPA buffer&nbsp;</td><td>self prepared</td><td>N/A</td><td>containing: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>RLT buffer</td><td>Qiagen</td><td>1015762</td><td>Included in RNeasy Mini Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate (for 0.1% solution)</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)</td><td>Sigma</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (for 0.3% solution)</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>CarlRoth</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;H2AX antibody (rabbit)</td><td>CellSignalling</td><td>2577S</td><td>Dilution 1:200&nbsp;</td></tr></tbody></table>

um protocolo padronizado para induzir senescência prematura induzida por estresse em melanócitos humanos primários usando hidroperóxido de tert-butila

A Standardized Protocol for Inducing Stress-Induced Premature Senescence in Primary Human Melanocytes Using Tert-butyl Hydroperoxide

Um protocolo padronizado para induzir senescência prematura induzida por estresse em melanócitos humanos primários usando hidroperóxido de tert-butila

Environmental stressors, including UV radiation, air pollution, or cigarette smoke, drive extrinsic skin aging. Exposure to these extrinsic aging factors ...

Nossa pesquisa foca em investigar o fenótipo de senescência de melanócitos e sua contribuição para o envelhecimento cutâneo extrínseco. Modelos estabelecidos de senescência utilizam fibroblastos e não conseguem capturar a biologia específica dos melanócitos. Este protocolo induz estresse oxidativo mediado por tBHP em melanócitos humanos primários.Para começar, reúna os reagentes necessários. Após o descongelamento dos melanócitos e um período de recuperação de três dias, certifique-se de que as células atinjam de 80 a 90% de confluência no dia da semeadura. Aspire o meio do frasco. Lave as células duas vezes com DPBS. Adicione dois mililitros de solução de tripsina-EDTA para destacar as células. Coloque o frasco no incubador por cinco minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Toque suavemente o frasco. E, sob o microscópio, observe as células para confirmar a dessanexão completa. Adicione 1,5 vez o volume de inibidor de tripsina para interromper a reação.Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Dilua a suspensão com DPBS até um volume final de 10 mililitros. Centrifugue a suspensão celular a uma força centrífuga relativa de 100 durante cinco minutos.Aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular no meio até o volume desejado. Semeie 600.000 células por placa de 10 centímetros para as placas tratadas com hidroperóxido de tert-butila, ou tBHP. Semeie 400.000 células por placa para as placas controle.Prepare uma solução trabalho de 10 milimolar a partir do estoque de tBHP usando DPBS ou meio de cultura. Adicione 100 micromolar de tBHP às células durante uma hora por tratamento. Mova a placa de um lado para o outro para distribuir o tBHP uniformemente por todo o meio.Coloque as células no incubador exatamente por uma hora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Aspire o meio para encerrar o tratamento com tBHP. Lave as placas duas vezes com DPBS pré-aquecido a 37 graus Celsius.Adicione o volume apropriado de meio fresco às placas. Coloque as placas no incubador e deixe as células recuperarem por pelo menos quatro horas antes do próximo tratamento. Repita o procedimento de tratamento mais tarde no mesmo dia para o segundo tratamento.Continue o regime de tratamento até o quarto dia, depois mantenha as células em cultura até o nono dia para avaliar os marcadores de senescência. Conte as células tratadas com tBHP e as células controle. Replante-as na mesma densidade inicial, ou, se forem obtidas menos de 600.000 células das placas tratadas com tBHP, replante todas as células coletadas.Conte as células nos dias quatro, nove e 15 do cultivo. No dia nove, lave as células duas vezes com PBS. Fixe as células utilizando formaldeído 2% e glutaraldeído 0,4%.Lave as células fixadas duas vezes com PBS. Incube as células fixadas em uma solução corante com pH 6. Cubra a placa para protegê-la da luz e, em seguida, incube por 18 horas a 37 graus Celsius na ausência de dióxido de carbono.Lave as células duas vezes com PBS. Usando microscopia de luz, registre imagens e conte o número de células coradas em azul. Divida esse valor pelo número total de células no mesmo campo.Expresse os resultados como a porcentagem de células positivas. Após a indução do estresse oxidativo, o tratamento com tBHP reduziu significativamente a proliferação dos melanócitos em comparação com os controles. As células tratadas atingiram apenas 1,4 duplicação populacional cumulativa, ou cPDL, no nono dia, enquanto os controles atingiram 3,1 cPDL.No dia 15, as células tratadas atingiram um platô em 1,9 cPDL, enquanto as células controle se expandiram até 5,1 cPDL. Os melanócitos tratados com tBHP apresentaram aumento na área da superfície celular em comparação com os controles em todos os pontos temporais medidos, com aumento progressivo até o dia 15, consistente com a morfologia alargada e achatada das células senescentes. Os melanócitos tratados com tBHP mostraram aumento na atividade da beta-galactosidase associada à senescência, ou atividade de SA-beta-galactosidase, com 32% de células positivas em comparação com 3% nos controles.O aumento na positividade para SA-beta-galactosidase foi consistente com um fenótipo senescente. A análise por imunofluorescência mostrou níveis elevados de gama-H2AX em melanócitos tratados com tBHP em comparação com os controles. As células tratadas exibiram sinal de gama-H2AX mais intenso do que os controles.A análise de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real demonstrou aumento na expressão de fatores do fenótipo secretório associado à senescência, sendo a interleucina-8 a que apresentou maior aumento. Enquanto isso, a interleucina-6 e a metaloproteinase da matriz-1 mostraram aumentos moderados. A análise por Western blot confirmou a indução da senescência.A laminina B1 mostrou uma redução significativa em melanócitos tratados com tBHP em comparação com os controles. Os níveis da proteína retinoblastoma fosforilada foram reduzidos em melanócitos tratados com tBHP em comparação com os controles. O tratamento com tBHP aumentou a expressão transcricional de p16 e p21 em melanócitos.Este modelo permite aos pesquisadores estudar como os melanócitos senescentes afetam a pigmentação e se comunicam com células vizinhas por meio de fatores inflamatórios do SASP. O desafio deste protocolo é o tempo preciso. O tBHP deve ser aplicado duas vezes ao dia, com intervalo de pelo menos quatro horas.Após este protocolo, a senescência pode ser caracterizada por meio da coloração associada à beta-galactosidase da senescência, imunofluorescência, RT-qPCR e Western blotting de marcadores estabelecidos de senescência.

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Biologia

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