Name: Montagem e uso de um sistema de crescimento gnótico vegetal para estudos de interação planta-microrganismo em cereais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a montar o sistema gnotobiótico GNOVA para cultivar cereais em condições microbianas controladas. Este protocolo permite estudar interações planta-microorganismo além da fase de plântula, com irrigação gerenciada e crescimento prolongado.

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<table><tbody><tr><td>Powerconnect cordless drill &amp; Kit de 100 peças</td><td>Black+Decker</td><td>BDC120VA100</td><td>1/4" e 1/8" brocas necessárias.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fita de vinil, amarela, 1" de largura x 36 jardas&nbsp;</td><td>3M</td><td>471</td><td>Material consumível</td></tr><tr><td>Elásticos Sterling tamanho #32&nbsp; (2 elásticos por sistema)</td><td>Amazon</td><td>B001I1QO00</td><td>Material consumível.&nbsp;</td></tr><tr><td>Semente de trigo</td><td></td><td></td><td>Cultivar usado neste experimento: Catawba</td></tr><tr><td>Isolamento de tubo de fibra de vidro, 3 " de largura x 1/2 " de espessura&nbsp; (2 círculos pré-cortados por sistema)</td><td>Lowe's</td><td>28930</td><td>Cortar em 2 círculos de 7/8 " (7,3 cm) de diâmetro. Material consumível. Para produção de alto rendimento de círculos, desenrrole o isolamento de tubo e use a borda aberta do pote para cortar o círculo colocando o pote em cima do isolamento de tubo e aplicando pressão e torção.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mídia de filtro DW4, pré-cortada para 15" x 75 jardas&nbsp; (1 círculo cortado por sistema)</td><td>Class Biological Clean, Ltd</td><td>NA</td><td>Cortar em círculos de 6,3 " (16,02 cm) de diâmetro. CBC tem outros tamanhos pré-cortados ou rolos padrão que podem ser comprados em vez disso, se desejado.&nbsp; Material consumível. Corte um modelo do círculo em papelão e use-o para desenhar círculos por toda a área da mídia DW4 e corte com tesouras.</td></tr><tr><td>Tubulação de silicone, Versilon SPX-50 alta resistência, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" espessura da parede</td><td>Saint-Gobain</td><td>ABX00007</td><td>Cortado em duas peças longas (16" // 40,64 cm) e três peças curtas (2,5" // 6,35 cm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio 5% de cloro disponível em solução aquosa</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Dilua para 2% v/v e use para o protocolo de esterilização de milho</td></tr><tr><td>Meio Murashige &amp; Skoog, elementos micro e macro. 25 L</td><td>Research Products International</td><td>M10200-25.0</td><td>Dilua para 0,5x de força</td></tr><tr><td>Etanol, 100%, Deacon Labs</td><td>Fisher scientific</td><td>04-355-451</td><td>Dilua para 95% v/v</td></tr><tr><td>Seringa 3 mL, trava luer não estéril&nbsp; (2 por sistema)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-817-117</td><td>Descarte o êmbolo e mantenha apenas o barril, encha com lã de vidro e tampe com papel alumínio.</td></tr><tr><td>Bicos de vidro, 250 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>470191-150</td><td>Cinco são necessários para esterilização de sementes de trigo</td></tr><tr><td>Semente de milho</td><td></td><td></td><td>Genótipo usado neste experimento: Mexico 21&ndash;22 B73XMo17</td></tr><tr><td>Bandeja de alumínio para assar 18" x 26"&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>B01FIK54LQ</td><td>Certifique-se de que se encaixa nas dimensões da sua capela de fluxo</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher scientific</td><td>BP358-1</td><td>Prepare uma solução de 0,145 M.</td></tr><tr><td>Base impressa em 3D, filamento de ácido polilático (PLA) usado (1 por sistema)</td><td>Protolabs</td><td>NA</td><td>A impressão e os arquivos editáveis podem ser encontrados nos materiais suplementares. Arquivos disponíveis em Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. NÃO AUTOCLAVE se PLA foi usado como filamento para produzir a base. PLA derrete acima de 150 &deg;C e pode ser deformado acima de 60 &deg;C. Recomenda-se que a integridade da base 3D impressa em PLA seja testada se for usada em temperaturas acima de 40 &deg;C. Para materiais de maior resistência ao calor, como PETG (polietileno tereftalato glicol) ou PC (policarbonato), podem ser usados; isso aumentará o custo da peça e ainda pode não ser autoclavável. A impressão 3D das protótipos da base foi realizada em uma impressora pessoal com volumes de construção de 256 &times; 256 &times; 256 mm (comprimento &times; largura &times; altura). Para eficiência em velocidade e custo, recomendamos a impressão em massa em provedores locais de serviços de impressão 3D comerciais.&nbsp;</td></tr><tr><td>Conexão macho luer para mangueira roscada 1/8 " ID, polipropileno livre de derivados animais&nbsp; (2 por sistema)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-50114-69</td><td>Referido como encaixe 1 no protocolo</td></tr><tr><td>Conexão macho slip luer para mangueira roscada 1/8 " ID, polipropileno livre de derivados animais&nbsp; (1 por sistema)</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-50114-63</td><td>Referido como encaixe 2 no protocolo</td></tr><tr><td>Grampos de mangueira de engrenagem de minhoca de aço inoxidável 201, 1 1/2" -3 1/2" diâmetro de aperto (1 por sistema)</td><td>Grainger</td><td>5CZF2</td><td>Referido como grampos de mangueira no protocolo</td></tr><tr><td>Gabinete de fluxo laminar Airstream Gen 3 com interruptor simples, dimensões 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 "&nbsp;</td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120707</td><td>Referido como capela de fluxo laminar no protocolo. Qualquer capela de fluxo laminar com dimensões semelhantes funciona. Modificações podem ser necessárias em capelas de fluxo laminar menores.&nbsp;</td></tr><tr><td>Areia de brincar, Quikrete Premium. 50 lb</td><td>The Home Depot</td><td>1001709466</td><td>Referido como areia no protocolo</td></tr><tr><td>Arame tecido de aço inoxidável 304, 120 malha (1 por sistema)</td><td>Amazon</td><td>B09KRS5F7T</td><td>Referido como malha de arame de aço inoxidável no artigo. Corte em círculos de 4,7" (11,9 cm) de diâmetro. Para alta produção de círculos ou produção de círculos, corte um modelo do círculo em papelão e use-o para desenhar círculos em toda a área de malha tecida da malha tecida e corte com tesouras.&nbsp;</td></tr><tr><td>Argila (Montmorilonita), OIL-DRI Sorbente Solto, 50 lb de peso, não perfumado</td><td>Grainger</td><td>44Z111</td><td>Referido no protocolo como argila. Material consumível.</td></tr><tr><td>Tubo de vela de furacão transparente sem fundo 4" OD x 30" de comprimento (1 por sistema)</td><td>WCG International</td><td>HST0430</td><td>Referido no protocolo como cilindro de vidro</td></tr><tr><td>Tampa de plástico transparente, 3" (7,6 cm) diâmetro

montagem e uso de um sistema de crescimento gnótico vegetal para estudos de interação planta-microrganismo em cereais

Assembly and Use of a Plant Gnotobiotic Growth System for Plant&#8211;Microbe Interaction Studies in Cereals

Montagem e uso de um sistema de crescimento gnótico vegetal para estudos de interação planta-microrganismo em cereais

The development of microbial-based agricultural amendments that work consistently in the field requires an understanding of the molecular mechanisms of ...

Nossa pesquisa investiga como microrganismos colonizam raízes de plantas e influenciam a resiliência da planta ao estresse. Este protocolo pode ser aplicado ao estudo das interações planta-microrganismo em uma ampla gama de espécies vegetais, indo além das tradicionais plantas modelo pequenas.Para começar, pegue os potes preparados para o experimento e remova a tampa plástica deles. Despeje 378 mililitros de meio Murashige e Skoog em concentração reduzida pela metade no pote. Para substratos de argila e areia, use 360 e 350 mililitros, respectivamente, para atingir 70% de porosidade preenchida com água. Usando pinças estéreis, plante as sementes esterilizadas na profundidade correta. Semeie trigo a uma profundidade de 0,5 polegadas e milho a uma profundidade de 1 polegada. Substitua a tampa plástica sobre o pote e, em seguida, retire o pote da cabine de fluxo laminar. Alternativamente, semeie plântulas estéreis pré-germinadas no GNOVA. Após transferir o pote e o cilindro de vidro para uma câmara de crescimento, segure o cilindro de vidro com a base voltada para baixo, próximo ao pote. Segure o envoltório de esterilização e a tampa plástica. Em um único movimento, remova rapidamente a tampa plástica do pote e o envoltório de esterilização do cilindro de vidro. Abaixe o cilindro de vidro sobre o topo do pote e assente-o na borda da base impressa em 3D. Cultive o trigo a 22 graus Celsius durante o dia e 16 graus Celsius à noite, sob luz fluorescente com um fotoperíodo de 12 horas. Para o milho, mantenha 27 graus Celsius durante o dia e 23 graus Celsius à noite nas mesmas condições.Conecte um trecho longo de tubo de silicone ao dispensador de topo de garrafa. Posicione a chama próxima à linha de irrigação. Remova o corpo da seringa da linha de irrigação e do suporte do filtro. Mantenha todas as extremidades dos tubos dentro da zona da chama. Conecte o suporte do filtro à linha de irrigação. Conecte os dois corpos de seringa. Em seguida, conecte o trecho longo de tubo ligado ao dispensador de topo de garrafa à porta inferior do suporte do filtro. Dispense 150 mililitros de meio de Murashige e Skoog em concentração metade. Separe os dois corpos de seringa. Desconecte o tubo de silicone do suporte do filtro e desconecte o suporte do filtro da linha de irrigação. Substitua-o por um corpo de seringa.Utilize uma estratégia de irrigação com solução de hipoclorito a 10% em experimentos grandes com mais de 50 amostras para aumentar a produtividade no regamento. Dispense solução de hipoclorito a 10% (v/v) em dois béqueres plásticos pequenos. Coloque os béqueres próximos à linha de irrigação e remova o corpo da seringa da linha de irrigação. Mergulhe as extremidades da tubulação em uma solução de hipoclorito a 10% até o momento de uso. Remova o corpo da seringa do suporte do filtro. Mergulhe todas as extremidades da tubulação na solução de hipoclorito a 10% até o momento de uso. Agite para remover o excesso de solução de hipoclorito. Conecte o suporte do filtro à linha de irrigação dos vasos. Conecte o trecho longo da tubulação ligado ao dispensador de frasco à porta inferior do suporte do filtro. Dispense 150 mililitros de meio Murashige e Skoog em concentração metade da original. Desconecte o trecho longo da tubulação de silicone da porta inferior do suporte do filtro. Substitua o filtro na linha de irrigação por um corpo de seringa após remover o excesso de hipoclorito. Se o volume de irrigação mudar, utilize cerca de 20 mililitros de meio para escovar a linha.Modifique o protocolo de colheita para alinhar com os objetivos específicos da pesquisa e o volume de amostras sendo processadas. Remova o cilindro de vidro do vaso. Coloque rapidamente o vaso na câmara de fluxo laminar e retire-o da base impressa em 3D. Segure a planta pela base e despeje o substrato do solo em um recipiente. Remova cuidadosamente grandes torrões de solo das raízes. Se necessário, colete amostras de solo de acordo com os objetivos específicos da pesquisa. Usando tesouras estéreis, separe os brotos das raízes. Registre o peso fresco dos brotos. Limpe as raízes agitando-as suavemente em um béquer contendo água desionizada. Seque as raízes com papel absorvente. Registre o peso fresco das raízes e, se necessário, colete amostras de raízes de acordo com os objetivos específicos da pesquisa.O trigo e o milho atingiram 100% de germinação dentro do GNOVA, enquanto no sistema de saco o trigo alcançou 67% de germinação e o milho alcançou 75% de germinação após duas semanas. O trigo cultivado dentro do GNOVA atingiu o estágio de crescimento Zadok 13. Enquanto isso, o trigo cultivado no sistema de saco permaneceu no estágio de crescimento Zadok 11. Na semana 5, o trigo dentro do GNOVA atingiu o estágio de crescimento Zadok 21, indicado pelo surgimento de perfilhos, enquanto os perfilhos estavam ausentes no sistema de saco e as plantas permaneceram no estágio de crescimento Zadok 13. Após 12 semanas de crescimento no GNOVA, as plantas de trigo exibiram mais folhas cloróticas e o cilindro de vidro estava cheio de biomassa vegetal. Quando as plantas de trigo foram cultivadas por mais duas semanas no GNOVA, não houve aumento significativo na biomassa. O crescimento do milho foi avaliado dentro do GNOVA por quatro semanas e comparado ao milho cultivado em sacos. A biomassa fresca do milho cultivado no GNOVA aumentou em 593% em relação àquela cultivada no sistema de saco. O milho cultivado dentro do GNOVA apresentou comprimento significativamente maior da parte aérea e das raízes do que o milho cultivado no sistema de saco.Este protocolo permite que pesquisadores estudem as interações planta-microbioma em condições controladas e estabeleçam causalidade entre efetores microbianos e respostas da planta. O aspecto mais desafiador deste protocolo é o manuseio cuidadoso das linhas de irrigação para manter a esterilidade. Estudos futuros podem combinar este sistema com comunidades microbianas sintéticas para identificar efetores que promovam o crescimento vegetal e investigar mecanismos de montagem da comunidade microbiana.

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Biology

Biologia

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