Alternativa de baixo custo para examinar preferência social em peixe-zebra (Danio rerio) usando a tarefa de 3 câmaras em aquário aberto e natação livre

Este protocolo valida uma tarefa de natação livre em tanque aberto com três câmaras, de baixo custo e código aberto, para investigar a preferência social em peixes-zebra. Este protocolo pode ser usado com diversas espécies e permite que pesquisadores de graduação investiguem a preferência social com recursos mínimos. Para começar, prepare o aparato de tanque aberto com uma câmara experimental central e duas câmaras de estímulo laterais.

Instale o sistema de iluminação traseira. Divisores opacos e filtros polarizadores para otimizar o isolamento visual e o contraste do vídeo. Monte e alinhe as câmeras em frente às câmaras utilizando o suporte de fixação para câmeras.

Feche as cortinas blackout e mantenha condições estáveis de contenção antes de iniciar o experimento. Baixe o Open Broadcaster Software e instale-o em um computador local com sistema operacional Windows. Após iniciar o software, execute o assistente de configuração automática para otimizar as configurações de acordo com as necessidades específicas de gravação, recursos de hardware e condições de rede.

Verifique as configurações básicas antes da configuração da câmera. Defina a resolução base da tela para corresponder à resolução do monitor e defina a resolução dimensionada de saída adequada. Em seguida, crie uma cena clicando com o botão direito na caixa de cenas e selecionando Adicionar Cena.

Assigne um nome à cena e use-o para definir o layout do fluxo. Adicione uma nova fonte e selecione Dispositivo de Captura de Vídeo para adicionar uma webcam. Atribua a cada câmera um nome distinto, como Câmera Central, e repita o processo para a câmera adicional.

Posicione e redimensione as fontes na janela de visualização. Certifique-se de que a câmera esteja listada na lista de fontes. Centralize a visualização da câmera no canvas pressionando Ctrl + D. Aplique o ajuste à tela pressionando Ctrl + F, ou estique a tela pressionando Ctrl + S. Recorte a fonte mantendo pressionada a tecla Alt enquanto arrasta a caixa delimitadora.

Em seguida, clique duas vezes na câmera selecionada e clique em Configurar Vídeo. Ajuste o brilho e o contraste do vídeo no menu de propriedades. Encha as três câmaras com água dos tanques de contenção e ajuste a temperatura da água antes de introduzir os peixes.

Certifique-se de que as barreiras opacas entre as câmaras permaneçam no lugar durante todo o período de aclimatação. Transfira um adulto de Danio rerio para a câmara central e permita que se aclimate por pelo menos uma hora. Coloque os estímulos sociais artificiais na câmara de estímulo esquerda lateral.

Em seguida, transfira um pequeno grupo de quatro peixes, composto por dois machos e duas fêmeas de tamanho, idade e grau de familiaridade semelhantes, para a câmara de estímulo direita. Durante a aclimatação, forneça a todas as câmaras que contêm animais vivos um aquecedor submersível ajustado a 26 graus Celsius, uma pedra difusora conectada à bomba de ar do aquário e uma tampa do tanque para manter condições estáveis de alojamento. Remova os aquecedores e as pedras difusoras antes de iniciar a sessão experimental.

Inicie a gravação com a câmera única no tanque central. Abra o software e redimensione a visualização da câmera central para preencher toda a tela, clicando e arrastando os cantos do vídeo. Em seguida, selecione Iniciar Gravação nos controles.

Remova imediatamente as barreiras opacas. Após 10 minutos, encerre a sessão selecionando Parar Gravação nos controles. Acesse as sessões gravadas selecionando Arquivo no menu superior esquerdo e escolhendo Mostrar Gravações no menu suspenso.

Carregue quatro a cinco vídeos em um aplicativo de análise de movimento, como o DeepLabCut, e extraia 20 a 30 quadros de cada vídeo. Defina pelo menos três pontos principais de rastreamento, como a cabeça, a cauda e o tronco. Treine a rede para rastrear esses pontos ao longo dos quadros.

Utilize uma rede neural baseada no ResNet-101 para treinar o modelo. Determine o número de iterações necessárias para concluir o treinamento. Em seguida, implante o modelo DeepLabCut totalmente treinado nos demais vídeos experimentais e extraia os dados de posição para cada ensaio seguindo o guia do usuário.

Em seguida, utilize um software de codificação, como o Python, para definir e analisar o movimento nas três zonas verticais do arena de largura igual, a fim de quantificar a preferência. Meça o tempo em cada zona utilizando pelo menos dois pontos corporais dentro da zona identificada para reduzir o ruído de rastreamento. Calcule o tempo total em cada zona dividindo o número total de quadros na zona pelo número total de quadros.

Utilize o mesmo software de codificação para definir e medir o tempo gasto imóvel, como o congelamento. Defina o limiar de movimento em 2 a 5 pixels por quadro com uma contagem mínima de quadros consecutivos de 15 quadros. Por fim, compile e exporte as medidas para análise estatística e visualização.

Os indivíduos passaram significativamente mais tempo da sessão na zona direita, mais próxima do cardume vivo, do que na zona central ou na zona esquerda, mais próxima do estímulo móvel artificial. A diferença no tempo gasto entre a zona central e a zona esquerda não foi estatisticamente significativa. Os indivíduos passaram significativamente menos tempo da sessão imóveis na zona central do que na zona direita, mais próxima do cardume vivo, ou na zona esquerda, mais próxima do estímulo móvel.

Este protocolo pode ser utilizado por pesquisadores para investigar a tendência de um peixe-zebra em interagir visualmente com dois estímulos sociais diferentes e determinar qual estímulo é preferido. Os pesquisadores podem usar diferentes espécies ou configurações de estímulos, bem como investigar outras respostas, como movimentos rápidos ou nado errático. O sistema oferece uma plataforma para estudar modelos translacionais da funcionalidade social e pode explorar manipulações farmacológicas e ambientais.