Caracterização da Estrutura e Função da Membrana Lipídio-Proteína usando Bicamadas de Interface de Gotículas

Neste trabalho, estudamos como as propriedades físicas e elétricas das membranas lipídicas e seu ambiente impactam a condução iônica em sistemas modelo de bicamada com interface de gotículas. A eletrofisiologia tradicional de pinça de patch não investiga a biofísica de membranas em escala maior, mas essa plataforma única captura tanto a atividade de canal único quanto áreas de membrana maiores em escala milimétrica para estudar mais extensivamente a biofísica das membranas. Para começar, prepare os eletrodos de fio de prata revestidos com agarosa clorada e as soluções de vesículas lipídicas para experimentos eletrofisiológicos.

Para a formação de bicamadas de interface de gotículas, coloque uma placa de Petri transparente no fundo do palco de um microscópio invertido. Encha o recipiente com óleo de alcano, como 100% hexadecano, até uma profundidade de aproximadamente cinco milímetros. Após fixar os eletrodos na cabeça do patch clamp e no suporte do eletrodo aterrado, use os controles do micromanipulador para baixar ambas as extremidades esféricas revestidas de agarose para dentro do óleo até uma profundidade de aproximadamente 2,5 milímetros abaixo da superfície do óleo, evitando movimentos rápidos para evitar colisões com a placa de Petri.

Ajuste o foco do microscópio até que ambas as extremidades da bola e seus revestimentos de agarose fiquem nítidos. Posicione os eletrodos próximos à borda do campo de visão, para que ambos possam ser observados simultaneamente. Usando uma pipeta calibrada de dois microlitros, aspire as vesículas lipídicas DPhPC extrudidas dopadas com gramicidina A. Dispense lentamente 250 nanolitros da suspensão diretamente em cada extremidade esférica revestida de agarose, usando uma ponta de pipeta separada para cada uma, sem tocar na casca de agarose.

Deixe as gotículas se espalharem pela superfície de agarose e descerem visivelmente devido à gravidade e à redução da tensão superficial, formando uma gota pendente. Observe o afundamento lateral através da parede da placa de Petri se estiver livre. Após cinco minutos, empurre suavemente a mesa antivibração para avaliar a gota.

Confirme que as gotículas caídas se movem com um leve atraso em relação ao movimento do eletrodo, indicando a formação de gotículas monocamada lipídicas totalmente revestidas. Se esse comportamento não for observado, espere mais dois a três minutos e repita a avaliação. Certifique-se de que o microscópio, a mesa antivibração, a gaiola de Faraday, o amplificador, o digitalizador, o gerador de funções e o computador estejam conectados a um aterramento comum.

Organize as conexões dos instrumentos de acordo com o guia de configuração do fabricante e configure a configuração elétrica e óptica essencial, seguindo as instruções detalhadas para experimentos com bicamadas de interface de gotículas. Configure um gerador de funções externo ou o canal de saída do software de aquisição para gerar uma forma de onda de tensão triangular de 10 Hertz e 10 milivolts. Confirme a amplitude e a frequência em um osciloscópio conectado e no software de aquisição.

Após as gotas caírem por aproximadamente 10 minutos, use os micromanipuladores para trazer as duas gotas em contato suave. Ligue a forma de onda triangular de 10 Hertz e 10 milivolts e monitore a resposta capacitiva de corrente no software de aquisição. Ajuste a área de contato da gotícula movendo ligeiramente os eletrodos até que a resposta de corrente capacitiva de pico a pico à forma de onda esteja entre aproximadamente 100 e 200 picoamperes.

Ou a área de contato não ultrapassa aproximadamente 1/4 do diâmetro da gotícula. Espere pela formação espontânea de duas camadas, indicada eletricamente por uma resposta capacitiva em expansão de pico a pico e opticamente por uma reflexão interna crescente com aparência oval na região de contato. Confirme que as bicamadas lipídicas puras exibem platôs de corrente retangulares em resposta ao estímulo de tensão triangular, enquanto as bicamadas dopadas com gramicidina A exibem platôs inclinados, refletindo condução iônica em conjunto.

Uma vez confirmadas as respostas estáveis-capacitivas ou condutivas, desligue a forma de onda triangular e permita que a bicamada da interface de gotículas se equilibre por pelo menos 15 minutos antes de aplicar protocolos de estimulação. No software de captura de vídeo, defina a taxa de quadros para pelo menos 20 quadros por segundo. Selecione as configurações apropriadas da câmera e da lente objetiva.

Em seguida, clique em Adquirir e selecione Novo Protocolo. Na aba Modo de Aquisição, selecione Estimulação Episódica. Defina corridas por tentativa e varridas por corrida para um.

Ajuste a duração do varremento para quatro segundos maior que a duração total do experimento, permitindo uma linha base pré e pós-estímulo de dois segundos. Defina a taxa de amostragem entre cinco e dez quilohertz. Na aba Entradas, atribua o canal de gravação à entrada atual.

E então, na aba Saídas, atribua o canal de estimulação à saída de tensão que controla os eletrodos. Abra a aba Forma de Onda. Na coluna A, defina o tipo para Passo, o primeiro nível e o nível delta para zero milivolts, e a primeira duração para 2.000 milissegundos para definir uma linha de base pré-estimulação.

Na coluna B, defina o tipo Pulso para facilitar pulsos pareados. Especifique os valores para a primeira duração e a amplitude de tensão de primeiro nível e defina a taxa de trem para definir o intervalo de interpulso correspondente ao ciclo de trabalho alvo. Ajuste a largura do pulso para 100 milissegundos.

Na coluna C, para depressão de pulso pareada, defina o tipo para Pulso com a mesma amplitude e duração do pulso. Ajuste a taxa de trem para alcançar o ciclo de trabalho desejado mais baixo e ajuste a largura do pulso. Em seguida, na coluna D, configure os parâmetros pós-estimulação idênticos ao ponto base pré-estimulação.

Revise o protocolo e salve com um nome descritivo. Inicie a gravação de vídeo e imediatamente inicie a aquisição elétrica e a estimulação clicando no botão Gravar em cada software. Durante os primeiros 60 segundos de estimulação, observe que a corrente aumenta e pode atingir um platô.

Durante os últimos 60 segundos, observe que a corrente diminui. Ao final do protocolo, interrompa a aquisição elétrica e a gravação de vídeo simultaneamente. Por fim, realize pós-processamento para extrair a área da membrana e calcular corrente, área e fluxo normalizados a partir de dados de imagem e elétricos.

Imagens sequenciais capturaram o zíper espontâneo em duas camadas e a expansão da área quando duas gotas caídas se tocavam. As reflexões ovais internas brilhantes no contato da gota foram usadas para estimar o diâmetro da bicamada e a área da membrana ao longo do tempo. Facilitação de pulsos pareados de zero a 60 segundos e depressão de pulso pareada de 60 segundos a 120 segundos foram entregues usando pulsos de 100 milissegundos.

As respostas representativas atuais durante os períodos e os padrões de estimulação foram registrados. Corrente normalizada para bicamadas DPhPC dopadas com gramocídina A em óleos hexadecano e dodecano/hexadecano é mostrada durante facilitação de pulsos pareados e depressão de pulsos pareados. A área normalizada da membrana medida em 30 pontos de tempo mostrou evolução semelhante em ambas as condições do óleo, apesar das correntes diferentes.

Fluxo normalizado separou as mudanças de condutância independentes de área e foi consistente com mudanças na condução membranar além da simples expansão de área. A estimulação prolongada por depressão pulsiva pareada por até 30 minutos produziu um comportamento prolongado semelhante à depressão nas membranas hexadecano, mas manteve fluxo elevado nas membranas dodecano/hexadecano, consistente com comportamento semelhante a potenciação a longo prazo. Esse protocolo nos permite medir como a estrutura da membrana e a condução de íons mudam por meio da reestruturação eletricamente conduzida das bicamadas da interface de gotículas.

Esta plataforma pode suportar muitos protocolos de estimulação diferentes em dibs com canais iônicos, sem canais iônicos e até canais fotoisomerizáveis para melhor sondar a dinâmica da membrana e as propriedades elétricas. Como essa plataforma sintonizável sonda tanto a biofísica de membrana em macroescala quanto em microescala, experimentos futuros melhorariam muito ao usar espectroscopia de fluorescência para separar com mais confiança a atividade dos canais proteicos da condução dos poros de membrana.