Perfil Lisossômico com LysoTracker para avaliação quantitativa da senescência celular em fibroblastos humanos

Estudamos a senescência celular e sua caracterização, focando em como características como alterações lisossômicas podem servir como marcadores de senescência. Marcadores convencionais de senescência são frequentemente baseados em pontos finais e binários, enquanto imagens de células vivas podem ler a senescência como um sinal quantitativo contínuo em diferentes condições. Para começar, semeie fibroblastos IMR-90 em uma placa de 24 poços e incube-os a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% até que formem uma monocamada subconfluente.

Registre a densidade de semeadura e o tempo entre a placagem e a coloração lisossômica de cada experimento. Aqueça todo o meio de cultura a 37 graus Celsius. Prepare uma solução de trabalho LysoTracker Deep Red de 75 nanomolares no meio e proteja-a da luz.

Misture a solução de trabalho por inversão suave. Selecione coortes de fibroblastos IMR-90 pré-senescentes e senescentes correspondentes, preparadas usando um método definido de indução por senescência. Confirme o fenótipo senescente monitorando as características de crescimento e a morfologia.

Aspire o meio gasto de cada poço. Adicione suavemente a solução de trabalho LysoTracker ao longo da parede de cada poço, evitando perturbações na monocamada. Incube as células com LysoTracker por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono a 5%.

Durante os últimos 10 minutos da incubação com LysoTracker, adicione Hoechst 33342 diretamente aos poços na concentração de trabalho recomendada pelo fabricante e misture balançando suavemente a placa. Remova o meio de tingimento ao final da incubação e enxágue as células uma vez com PBS pré-aquecido para reduzir a fluorescência de fundo. Imediatamente após o enxágue, adicione um meio de cultura vermelho sem fenol pré-aquecido.

Prossiga diretamente para a imagem de células vivas, mantendo o tempo entre a troca de buffer e a aquisição de dados consistente em todos os poços. Rotule os poços paralelos na placa de cultura para a coloração de beta-galactosidase, a fim de comparar células altamente senescentes com os controles pré-senescentes. Imagem completa de células vivas para os poços de validação antes da fixação.

Registre as coordenadas do estágio durante a imagem ao vivo para realocar os mesmos campos após a fixação. Adicione a solução de fixação do kit de coloração de senescência beta-galactosidase, contendo 2% de formaldeído e 0,2% de glutaraldeído, às células. Cubra a placa com a tampa e incube por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente.

Remova o fixador e enxágue os poços duas vezes com PBS. Depois, adicione a solução de coloração beta-galactosidase contendo o substrato X-gal a pH 6 em cada poço. Sele a placa com parafilme para limitar a evaporação durante a incubação e coloque a placa em uma incubadora seca a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono por 12 a 16 horas.

Após a fixação e coloração, coloque a placa no palco do microscópio e realoque os mesmos campos de imagem usando as coordenadas registradas do estágio. Inspecione os poços sob um microscópio de campo claro e documente o padrão de coloração. Adquira imagens representativas para cada condição e determine a fração de células beta-galactosidase positivas associadas à senescência por poço.

Células senescentes apresentaram regiões brilhantes e espacialmente expandidas com lisossomos paranucleares, enquanto controles pré-senescentes apresentaram sinal geral menor com estruturas pontuadas discretas. As condições senescentes apresentaram uma fração maior de células beta-gal positivas do que os controles pré-senescentes. Foi observada uma forte correlação entre a intensidade do LysoTracker e a área beta-gal positiva associada à senescência nos poços replicados.

A intensidade média do LysoTracker dentro da máscara positiva foi maior em culturas senescentes do que em culturas pré-senescentes, tornando-se o discriminador em nível de campo mais robusto entre as duas condições. A intensidade integrada do LysoTracker por núcleo também foi maior em culturas senescentes no campo representativo mostrado. Esse protocolo permite que pesquisadores meçam a remodelação lisossômica em células vivas, fornecendo uma leitura quantificável de uma única célula da carga e progressão da senescência.

É importante manter as configurações de coloração e imagem idênticas em todos os poços, já que comparações de intensidade são válidas apenas em uma sessão. Estudos futuros podem estender esse procedimento para modelos tridimensionais, tipos celulares adicionais e validação em diferentes sistemas e fluxos de trabalho de microscópio.