Name: Perfil Lisossômico com LysoTracker para avaliação quantitativa da senescência celular em fibroblastos humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-17T12:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Aprenda a quantificar remodelamento lisossômico em fibroblastos humanos IMR-90 usando LysoTracker Deep Red. Este método de imagem em células vivas oferece uma leitura quantitativa indireta da senescência celular.

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<table><tbody><tr><td>24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229124</td><td>Qualquer placa de cultura multi-poço de fundo transparente compatível com imagem de fluorescência de células vivas (por exemplo, placas de poliestireno TC-tratadas de 6, 12 ou 24 poços; placas de imagem de fundo de vidro podem ser preferidas para imagem de alta resolução).</td></tr><tr><td>Beta-galactosidase staining kit (ensaio de senescência)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9860</td><td>Qualquer kit comercial de SA-&beta;-galactosidase com tampão de coloração verificado a pH 6,0. Para referência, a solução de fixação contém 2% de formaldeído e 0,2% de glutaraldeído em PBS, e a solução de coloração contém 1 mg/mL de X-gal em DMF, 40 mM de citrato/fosfato pH 6,0, 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de ferricianeto de potássio, 150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2.</td></tr><tr><td>BioRender (software de ilustração científica)</td><td>BioRender</td><td>N/A &mdash; aplicação web</td><td>Utilizado para criar figuras esquemáticas (Figuras 1&ndash;3). https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>Carbon dioxide gas (CO2), compressed cylinder</td><td>Airgas (ou fornecedor similar)</td><td>N/A</td><td>CO2 de grau médico usado para manter atmosfera de 5% no incubador de cultura celular e na câmara de imagem em estágio.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS), heat-inactivated</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10082147</td><td>Qualquer FBS de grau de cultura celular, inativado por calor a 56 &deg;C; usado a 10% v/v no meio de cultura completo.</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope with live-cell capability</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF7000</td><td>Qualquer microscópio de fluorescência de campo amplo ou confocal com controle de temperatura e CO2 para células vivas, conjuntos de filtros para canais de infravermelho distante (excitação ~647 nm / emissão ~670 nm) e DAPI/Hoechst (excitação ~405 nm / emissão ~460 nm), e uma objetiva de 20&times;-40&times; com NA suficiente para resolver características lisossômicas. O sistema de imagem EVOS M7000 foi usado neste estudo.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 nuclear stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Corante de DNA permeável a células para coloração nuclear de células vivas (fluorescência azul, excitação ~405 nm). Não intercambiável com DAPI, que não é permeável às células sob condições fisiológicas.</td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Python Software Foundation</td><td>N/A</td><td>Qualquer ambiente de computação científica que suporte segmentação do núcleo, expansão da região do núcleo para a célula, thresholding de intensidade e estatísticas básicas de imagem (por exemplo, Python com scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). O pipeline SenTrack (ver Arquivo Suplementar S1) foi desenvolvido para este estudo.</td></tr><tr><td>IMR-90 human lung fibroblasts (cell line)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Linha de células de fibroblastos diploides fetais humanos normais usada para modelar senescência replicativa; qualquer linha de fibroblastos humanos com características semelhantes pode ser substituída.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>L12492</td><td>Corante fluorescente acidotrópico para coloração de organelas ácidas em células vivas; fornecido como estoque de 1 mM em DMSO. A concentração de trabalho é de 75nM na mídia de cultura celular preparada.  A emissão de infravermelho distante (ex 647 nm / em 668 nm) minimiza a sobreposição com a autofluorescência da lipofuscina, mas não a elimina.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11-095-080</td><td>Meio de cultura basal para fibroblastos IMR-90; suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Qualquer formulação padrão de Minimum Essential Medium de Eagle com sais de Earle e L-glutamina pode ser substituída.</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin solution (100&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15140122</td><td>Suplemento antibiótico para meio de cultura completo; usado a 1% v/v (concentração final 100 U/mL de penicilina, 100 &mu;g/mL de estreptomicina). Qualquer solução padrão de pen-strep pode ser substituída.</td></tr><tr><td>Phenol red-free imaging medium</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>A1896701</td><td>DMEM ou HBSS sem fenol vermelho usado para imagem de células vivas para reduzir a fluorescência de fundo durante a aquisição. FluoroBrite DMEM é uma opção comumente usada; qualquer tampão de imagem sem fenol vermelho suplementado com 10% de FBS pode ser substituído.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 (1&times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td>Tampão isotônico para lavagem celular e diluição de reagentes; qualquer PBS 1&times; estéril a pH 7,4 pode ser substituído.</td></tr><tr><td>SenTrackLite v0.5.0 (software)</td><td>Open-Source (Estrada / Melendez Lab)</td><td>v0.5.0</td><td>Aplicação Python / Tkinter de arquivo único de código aberto para análise de imagem de senescência lisossômica. Distribuído como Arquivo Suplementar S1. Arquivado em Zenodo, doi:10.5281/zenodo.19701255. Licença MIT. Fonte: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack</td></tr><tr><td>Stage-top environmental chamber</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMC2000</td><td>Câmara ambiental para imagem de células vivas em microscópio com controle de temperatura (37 &deg;C) e CO2 (5%). O EVOS Onstage Incubator foi usado neste estudo; qualquer incubadora de topo de estágio equivalente pode ser substituída.</td></tr></tbody></table>

perfil lisossômico com lysotracker para avaliação quantitativa da senescência celular em fibroblastos humanos

Lysosomal Profiling With LysoTracker For Quantitative Assessment of Cellular Senescence In Human Fibroblasts

Perfil Lisossômico com LysoTracker para avaliação quantitativa da senescência celular em fibroblastos humanos

Cellular senescence is a stable cell-cycle arrest state associated with characteristic phenotypes, including enlarged cell morphology, altered secretory ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo ilustra um ensaio baseado em citometria de fluxo para quantificar células cancerígenas senescentes induzidas por terapia com marcadores de senescência duplos. A detecção e quantificação de células senescentes envolvem o uso de um substrato de β-galactosidase. O substrato é clivado por β-galactosidase lisossômica ativa dentro das células senescentes, produzindo um produto fluorescente que, em conjunto com grânulos de lipofuscina autofluorescentes, marca as células cancerígenas...

Quantificação baseada em citometria de fluxo de células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

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Um método sensível para quantificar células senescentes Câncer

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Aqui, vamos discutir uma série de protocolos para indução e validação da senescência celular em culturas de células. Podemos focar diferentes estímulos indutores senescência e descrever a quantificação de marcadores comuns associadas a senescência. Nós fornecemos detalhes técnicos utilizando fibroblastos como modelo, mas os protocolos podem ser adaptados para vários modelos de celulares.

Indução e validação da senescência celular em células humanas primárias

ROS intracelular foi mostrado para jogar um papel importante na indução da senescência celular. Aqui, descrevemos um ensaio sensível para quantificação dos níveis ROS durante a senescência celular. Nós também fornecemos protocolos para avaliar o fenótipo secretor associada a senescência, que alegadamente contribui para várias desordens relacionadas com a idade.

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A senescência celular é o fator-chave no desenvolvimento de patologias crônicas relacionadas à idade. A identificação da terapêutica que visam as células senescentes mostra a promessa de estender o envelhecimento saudável. Aqui, nós apresentamos um ensaio novo à tela para a identificação do senotherapeutics baseado na medida da atividade associada da senescência β-galactosidase em únicas pilhas.

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Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

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Ensaio de Imunofluorescência Multiplexada para Avaliação Espacial de Marcadores de Senescência in vivo

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Detecção de Senescência usando luz refletida na fração vascular estromal adiposa

Aprenda a quantificar remodelamento lisossômico em fibroblastos humanos IMR-90 usando LysoTracker Deep Red. Este método de imagem em células vivas oferece uma leitura quantitativa indireta da senescência celular.

Perfil Lisossômico com LysoTracker para avaliação quantitativa da senescência celular em fibroblastos humanos

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