Identificação de Potenciais Candidatos Anti-TB: Um Guia Passo a Passo para Síntese, Determinação de CMI e Avaliação de Citotoxicidade em Células de Mamíferos

O foco de nossa pesquisa é o desenvolvimento e validação de novos candidatos a medicamentos antituberculosos voltados para avançar estratégias terapêuticas. A pipeline de triagem fenotípica preventiva pode ser usada na busca por novos medicamentos contra cepas de Mycobacterium tuberculosis. Para começar, reúna os reagentes necessários e prossiga preparando a mistura de reação usando as proporções apresentadas.

Mexa a mistura de reação a 85 graus Celsius por 16 horas. Use um evaporador rotativo para remover o solvente. Adicione aproximadamente 20 mililitros de solução saturada de bicarbonato de sódio ao resíduo.

Filtre essa suspensão usando um papel de filtro qualitativo de celulose de 11 micrômetros para coletar os sólidos residuais. Dissolva os sólidos residuais em 50 mililitros de clorofórmio. Use um funil separador para enxaguar a solução de clorofórmio com 15 mililitros de água três vezes.

Removendo a camada de água toda vez. Adicione sulfato de sódio anidro à fase orgânica para remover a água residual e secá-la. Após evaporar o solvente, lave o sólido verde resultante quatro vezes com 10 mililitros de hexano quente a aproximadamente 50 graus Celsius.

A um miligrama do Composto 6, adicione um mililitro de uma mistura um a um de acetonitrila e metanol para preparar uma solução de estoque. Dilua a solução original a 0,5 miligramas por mililitro e filtre antes da análise. Carregue a amostra no sistema HPLC.

Use softwares de aquisição de dados de cromatografia para adquirir e processar os dados. Configure o método cromatográfico para usar uma coluna C18 de fase reversa de 250 por 4,6 milímetros com tamanho de partículas de cinco micrômetros. Ajuste a vazão para 1,5 mililitros por minuto e a detecção UV em 254 nanômetros.

Configure um gradiente conforme apresentado com as mudanças programadas de composição de fase móveis. Transfira aproximadamente de 15 a 20 miligramas do Composto 6 para um tubo de ressonância magnética nuclear ou RMN. Dissolva-o em um volume apropriado de DMSOD6.

Uma vez que os parâmetros de aquisição estejam definidos conforme apresentado, adquira o espectro de RMN de prótons usando uma sequência padrão de pulsos. Ajuste os parâmetros de aquisição. Inicie o espectro de RMN de prótons e carbono 13 e relate mudanças químicas em partes por milhão.

Visualize e processe os dados da RMN com o arquivo livre de decaimento por indução obtido do experimento. Para a purificação do Composto 6 baseada em cromatografia, preencha uma coluna com gel de sílica. Carregue o Composto 6 bruto na coluna.

Elude o composto e colete frações. Monitore as frações usando cromatografia de camada fina e combine as frações que contêm o produto puro. Adicione 100 microlitros de caldo 7H9 complementado com 10% de albumina dextrose catalase ou ADC à coluna 12 da placa de 96 poços.

Depois, transfira 100 microlitros de caldo 7H9 contendo 10% de ADC e 5% de DMSO para a coluna 11. E então, sequencialmente, da coluna nove para a um. Adicione 200 microlitros da solução composta à coluna 10, atribuindo uma linha por composto.

Pipete 100 microlitros da solução composta em dobro da maior concentração de teste para a coluna 12 da placa de 96 poços. Transfira 100 microlitros da coluna 10 para a coluna nove e misture bem pipetando para iniciar uma diluição dupla do cereal. Continue a diluição serial sequencialmente até a coluna um.

Adicione 100 microlitros da suspensão bacteriana do mycobacterium tuberculosis sequencialmente da coluna 11 até a coluna um e cubra a placa. Fele a placa com parafilme e incube a 37 graus Celsius por sete dias. Em seguida, adicione 60 microlitros de solução de resazirina 0,01% em cada poço da placa e cubra-a.

Fele a placa com parafilme e incube-a a 37 graus Celsius por 48 horas. Depois verifique se a cor muda de azul para rosa. Prepare uma solução funcional de 0,5 miligramas por mililitro de MTT em DMEM sem soro.

Obtenha células Vero e HEPG2 tratadas com o Composto 6 por 48 horas e inspecione para avaliar os efeitos do tratamento. Aspire o meio das placas e adicione 50 microlitros da solução de trabalho MTT a cada poço sob condições de baixa luz ambiente. Após uma incubação de três horas, adicione 100 microlitros de DMSO a cada poço para dissolver os cristais de formazan sob condições de baixa luz ambiente.

Coloque a placa em um agitador orbital a 100 RPM por 15 minutos, mantendo-a protegida da luz. Inspecione os poços de controle para confirmar a dissolução completa dos cristais. Coloque a placa em um microleitor de placas.

Defina o comprimento de onda de referência de 630 a 690 nanômetros e verifique a absorvância em 570 nanômetros. Prepare uma solução vermelha neutra de trabalho de 40 microgramas por mililitro em DMEM sem soro. Em seguida, prepare a solução de dessorção vermelha neutra contendo 1% de ácido acético glacial, 49% de etanol e 50% de água ultrapura em volume.

Uma vez avaliado o efeito do Composto 6 nas células Vero e HEPG2, remova o meio e adicione 100 microlitros da solução neutra de trabalho vermelha filtrada a cada poço. Incube a placa por duas horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após remover a solução vermelha neutra de trabalho, enxágue cada poço uma vez com 150 microlitros de PBS estéril.

Adicione 150 microlitros da solução de dessorção vermelha neutra a cada poço. Coloque a placa sobre um agitador orbital a 150 RPM por 15 minutos para extrair o corante. Verifique os poços de controle para confirmar a extração completa do corante.

Leia a absorvância a 540 nanômetros com um leitor de microplaca. O cromatografia HPLC mostrou que o Composto 6 teve um tempo de retenção de 14,11 minutos e pureza de 99%. O espectro de RMN de prótons mostrou sinais característicos para a metade piperidina entre 1,50 e 3,13 partes por milhão. Uma singeta de metilo a 2,38 partes por milhão.

E sinais aromáticos incluindo doublets em 6,97 e 7,17 partes por milhão e um multiplete em 7,63 a 7,75 partes por milhão. O espectro de RMN de carbono 13 mostrou um sinal de metilcarbono em 23,81 partes por milhão, e sinais relacionados à piperidina entre 24,85 e 49,70 partes por milhão. A placa MTT apresentou um gradiente claro de cor entre as concentrações de compostos, indicando que a citotoxicidade era maior em concentrações altas de compostos em poços translúcidos e menor em concentrações baixas em poços roxos profundos.

A placa de absorção vermelha neutra apresentou um gradiente de cor claro entre as concentrações de compostos, indicando que a citotoxicidade era maior em concentrações altas de compostos em poços translúcidos e menor em concentrações baixas em poços rosa profundo. Esse protocolo representa um canal para o desenvolvimento de candidatos a medicamentos contra a tuberculose com base em triagem fenotípica. É importante considerar e avaliar a baixa solubilidade dos compostos sintetizados ao aplicar o protocolo.

Essa pesquisa pode servir de base para futuros estudos de biodisponibilidade, infecção por macrófagos e in vivo.