Um método para adaptar Euglena gracilis a substratos à base de mandioca para cultivo heterotrófico

Nossa pesquisa foca em adaptar novas folhas de Euglena gracilis aos resíduos de mandioca e estudar o crescimento, a redução de cianeto e a produção de biomassa rica em proteínas. Esse protocolo pode ser aplicado no processamento sustentável de mandioca, valorização de resíduos agrícolas, produção de rações e sistemas biotecnológicos de baixo custo. Para começar, rotule os frascos ventilados estéreis de 500 mililitros com o tipo de substrato como garri.

Marque a concentração apropriada do alvo no frasco. Rotule o frasco com a identificação replicada e a condição planejada de esterilização como autoclavada ou não autoclaveada. Coloque um barco de pesagem na balança analítica.

Após pressionar tare, pese o garri para corresponder ao volume final de trabalho. Adicione assépticamente o garri pesado em um frasco estéril de 500 mililitros contendo 300 mililitros de água deionizada ou destilada. Reaplique a tampa ventilada em cada frasco.

Misture cada suspensão por três minutos até que a mistura fique homogeneizada. Se for usado mexer magnéticamente, coloque o frasco sobre uma placa de agitação e ajuste a velocidade para 200G para formar um vórtice raso sem respingos. Deixe a suspensão hidratar sem perturbação por 10 minutos a 25 graus Celsius.

Aperte a tampa de ventilação imediatamente antes da fermentação e agite o frasco manualmente cinco vezes para homogeneizar suavemente a mistura e ressuspender o material sedimentado. Para preparar meios adicionais de mandioca, rotule os frascos e pese o substrato, conforme demonstrado anteriormente, para alcançar 30 gramas por litro com base no volume de trabalho. Adicione assépticamente o substrato pesado em um frasco estéril contendo 300 mililitros de água deionizada ou destilada.

Reaplique a tampa ventilada em cada frasco. Hidrate e misture a suspensão como demonstrado anteriormente. Confirme que os frascos possuem uma tampa ventilada estéril permeável ao gás para permitir a troca de gás, minimizando a contaminação ambiental.

Coloque os frascos em posição vertical a 25 graus Celsius em uma área designada, longe da luz solar direta e do fluxo de ar de alto tráfego, e incube os frascos sem agitação por no mínimo 72 horas. Registre a data e o horário de início da fermentação para cada frasco e condição. Confirme que cada garrafa de 500 mililitros contém no máximo 300 mililitros de líquido após a fermentação para evitar o ebulição durante a esterilização.

Assim que a tampa ventilada estiver afrouxada para uma posição apertada com o dedo, aperte fita indicadora de autoclave no frasco. Após carregar os frascos em uma bandeja segura para autoclave, coloque a bandeja no autoclave e selecione o ciclo líquido P13. Defina os parâmetros de esterilização para 121 graus Celsius por 30 minutos para esterilização líquida.

Inicie o ciclo do autoclave. Após o ciclo concluir, permita que a pressão da câmara do autoclave retorne à pressão atmosférica e abra a porta do autoclave lentamente. Usando luvas resistentes ao calor, remova os frascos e deixe-os esfriar até a temperatura ambiente.

Armazene os frascos resfriados durante a noite em temperatura ambiente antes da inoculação. Use o meio de mandioca fermentado diretamente, sem autoclavar, para preservar comunidades microbianas nativas. Inocule o meio não autoclavado imediatamente após o período de fermentação de 72 horas para minimizar a contaminação ambiental não intencional.

Mantenha manuseio consistente entre réplicas usando o mesmo tipo de frascos ventilados de 500 mililitros, o mesmo volume de trabalho e a mesma duração de fermentação para todas as condições do substrato. Inocule Euglena gracilis em meio nutritivo fresco e heterotrófico. Incubar as culturas na completa escuridão a 28 graus Celsius com oscilação orbital contínua a 120G até que as culturas atinjam crescimento médio logarítmico.

Usando um microscópio óptico composto em modo campo claro, examine as culturas com ampliação total de 100x a 400x e confirme motilidade ativa, morfologia celular alongada e baixos níveis de insistência. Exclua culturas que apresentem detritos celulares excessivos, morfologia anormal ou insistência elevada antes dos experimentos de adaptação. Após homogeneizar suavemente as culturas iniciais apertando a tampa de ventilação, agite os frascos manualmente por 15 segundos para garantir uma distribuição uniforme das células sem induzir estresse excessivo.

Usando um hemocitometro Neubauer, determine a densidade celular. Depois de misturar a cultura, girando o frasco por 15 segundos, pipete um mililitro de cultura em um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Limpe o hemocitômetro e a capa de cobertura com etanol a 70% e deixe o hemocitômetro e a capa de cobertura secarem ao ar.

Pipete 10 microlitros de cultura nas duas grades do hemocitômetro e coloque a tampa sobre a amostra úmida. Usando microscopia de campo claro com objetivo 10x, foque na grade e conte as células dentro de um conjunto definido de quadrados na grade grande aplicando as regras padrão de fronteira. Repita a contagem de células na segunda câmara e calcule a média de células por mililitro e a densidade celular.

Ajuste os volumes de inoculação para alcançar um inoculo final de 5% volume por volume em todos os meios experimentais. Prepare unóculos separados para cada condição de tratamento para manter densidades celulares iniciais consistentes entre os grupos experimentais. Adicione o inóculo preparado de E. gracilis a meios de mandioca autoclavados e não autoclavados preparados em concentrações finais de garri de 10, 20 e 30 gramas por litro.

Use volumes iguais de inoculação em todas as condições de tratamento para padronizar a densidade celular inicial. Após apertar a tampa ventilada, gire suavemente o frasco em um movimento circular por 15 segundos para distribuir as células. Incube as culturas na completa escuridão a 25 graus Celsius para iniciar o crescimento heterotrófico.

Minimizar a agitação do meio não autoclavado para preservar a estrutura da comunidade microbiana nativa e a estratificação do substrato. Misture todas as culturas uma vez ao dia usando um movimento manual suave por 15 segundos para manter o contato entre as células de E. gracilis e o material de mandioca suspenso. Usando uma ponta de pipeta estéril, a cada 48 horas, colete asepticamente amostras de um mililitro de cada cultura.

Aperte a tampa ventilada e faça girar suavemente o frasco de cultura por 15 segundos antes da amostra para garantir uma distribuição uniforme das células e do material suspenso. Após transferir uma aliquota de cultura para um tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mililitros, dilua a amostra com água deionizada conforme necessário para melhorar a visualização das células individuais. Prepare uma lâmina de microscópia de montagem úmida pipetando 10 microlitros da amostra diluída em uma lâmina de microscópio limpa e cobrindo a amostra com uma lâmina de cobertura.

Utilizando um microscópio óptico composto em modo campo claro, examine as amostras com ampliação total de 100x a 400x e avalie a motilidade celular, morfologia e frequência de insistência como indicadores do status de adaptação. A cada sete dias, transfere asépticamente 20% do volume por volume de cada cultura para meio de mandioca recém-preparado, com as mesmas condições de concentração de garri e esterilização. Mantenha volumes de transferência consistentes entre passagens e repita a passagem serial até que as culturas apresentem crescimento consistente, motilidade sustentada e baixa frequência de insistência em meios mandioca de 30 gramas por litro.

Após a adaptação da mandioca em alta concentração e análise comparativa de crescimento, utilize tiras colorimétricas para avaliar os níveis de cianeto e observar a cor desenvolvida. Após a centrifugação, colhe biomassa para análise a jusante. Em condições de cultivo totalmente escuras, culturas cultivadas a 30 gramas por litro de garri apresentaram crescimento integrado maior do que concentrações mais baixas.

Concentrações menores de garri, de 10 a 20 gramas por litro, mostraram crescimento detectável, porém reduzido e mais variável. Concentrações mais altas de 40 a 50 gramas por litro atingiram densidades celulares de pico elevadas, mas apresentaram estabilização tardia e maior variabilidade. Os ensaios de exclusão com azul de tripano indicaram que culturas mantidas em 30 gramas por litro de garri mantiveram alta viabilidade nos pontos de tempo amostrados.

Concentrações mais altas de garri mostraram reduções transitórias na viabilidade, seguidas por recuperação parcial com aumento da variabilidade ao longo do tempo. Os desfechos positivos incluíram células arredondadas ou semi-insistentes com motilidade reduzida que permaneceram intactas durante a subcultura repetida. Culturas adaptadas de E. gracilis apresentaram crescimento reprodutível em múltiplos tipos de substrato e apresentaram estabilização mais precoce com redução do declínio em estágio tardio em relação às culturas do tipo selvagem.

A implementação bem-sucedida do protocolo resultou em biomassa de E. gracilis com teor mensurável de proteína bruta, conforme quantificado por análise laboratorial externa usando o método de combustão de Dumas. As porcentagens de proteína observadas em culturas adaptadas foram comparáveis às medidas em culturas do tipo selvagem com maior produção total de proteínas, correspondendo ao aumento do acúmulo de biomassa. Esse protocolo permite que pesquisadores estudem o crescimento de Euglena, redução de cianeto, produção de biomassa e potencial nutricional em diferentes ambientes baseados em mandioca.

O desafio crítico desse protocolo é manter uma temperatura estável, condições consistentes de cultura e uma comunidade microbiana equilibrada para o crescimento de Euglena. Estudos futuros podem otimizar e ampliar esse protocolo, melhorar o rendimento de proteínas e testar diferentes aplicações industriais usando diversos fluxos de resíduos de mandioca em grande escala.