Name: Um método para adaptar Euglena gracilis a substratos à base de mandioca para cultivo heterotrófico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Aprenda a adaptar Euglena gracilis a substratos de mandioca para cultivo heterotrófico. Este método estabelece linhagens tolerantes à mandioca, permitindo valorização de resíduos agroindustriais e produção sustentável de biomassa proteica.

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<table><tbody><tr><td>Autoclave - 533LS Steam Sterilizer</td><td>Getinge</td><td>533LS</td><td>Esterilização a vapor de meios de mandioca. Esterilize os meios usando o ciclo líquido.</td></tr><tr><td>Bright-Line&trade; Hemacitômetro substituição lâmina de cobertura</td><td>Millipore Sigma</td><td>BR723015- 100EA</td><td>Lâminas de cobertura espessas especializadas projetadas para uso em hemacitômetro.</td></tr><tr><td>Polpa seca de mandioca</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Substrato de mandioca fornecido</td></tr><tr><td>Pellets de mandioca</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Substrato de mandioca fornecido</td></tr><tr><td>Descascar mandioca</td><td>Psaltry International</td><td>N/A</td><td>Substrato de mandioca fornecido</td></tr><tr><td>Mandioca substrato (garri)</td><td>Fornecedor local</td><td>N/A</td><td>Garri derivado de mandioca usado como fonte de carbono preparado com água desmineralizada.</td></tr><tr><td>Centrífuga Thermo Scientific Sorvall Centrífuga ST16</td><td>Thermo Scientific Sorvall Centrífuga ST16</td><td>75004241</td><td>Capaz de &ge; 3.500 &times; g, usada para colheita de biomassa.</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Ex. Axygen (A Marca Corning)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C-S</td><td>Estéreo, volume mínimo de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Água limpa Ex. UltraPure&trade; Água Destilada Livre de DNase/RNase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977035</td><td>Desmineralizada ou destilada. Usada na preparação do meio</td></tr><tr><td>Microscópio de luz composta</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Microscópio composto padrão adequado para observação e contagem de células de rotina.</td></tr><tr><td>Teste de cianeto Tiras, colorimétrico. CN- 10-30 mg/L</td><td>MQuant</td><td>110044</td><td>Detecção semi-quantitativa de cianeto. Descarte como resíduo perigoso</td></tr><tr><td>Barco de pesagem padrão estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td>Usado para pesar substratos de mandioca e biomassa seca.</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (linhagem adaptada )</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Cepa adaptada à mandioca gerada neste estudo</td></tr><tr><td>Euglena gracilis (Tipo selvagem)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Cepa de referência não adaptada. Mantenha as mesmas condições padrão.</td></tr><tr><td>Componentes do meio de crescimento de Euglena</td><td>Vários</td><td>N/A</td><td>Meio basal de Euglena preparado de acordo com formulações padrão do laboratório.</td></tr><tr><td>Secador de congelamento FreeZone 6 Litros Console</td><td>Labconco</td><td>70061xxxx</td><td>Usado para desidratação de biomassa</td></tr><tr><td>Hemacitômetro com Linhas Padrão</td><td>Weber Scientific</td><td>NC1587539</td><td>Usado para contagem manual de células.</td></tr><tr><td>Agitador magnético com placa quente</td><td>IKA</td><td>N/A</td><td>Opcional; melhora a consistência durante a preparação do meio e suspensão do substrato.</td></tr><tr><td>Micropipetas (P20, P200, P1000)</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Pipetas de volume ajustável usadas para transferências assépticas de líquidos.</td></tr><tr><td>Minicentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Opcional; facilita a rápida sedimentação durante a colheita de biomassa.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Usado para selagem temporária de frascos ou placas quando tampas ventiladas não estiverem disponíveis.</td></tr><tr><td>Faixas indicadoras de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-520</td><td>Alternativa ao medidor de pH para avaliação qualitativa rápida do meio de cultura.</td></tr><tr><td>Medidor de pH com sonda Thermo Scientific Orion Star A211 Medidor de pH de bancada</td><td>Thermo Scientific Orion Star A211 Medidor de pH de bancada</td><td>13-645-519</td><td>Calibrado antes do uso. Para medir o pH do sobrenadante da cultura</td></tr><tr><td>Armazenamento refrigerado (4&deg;C)</td><td>Frigidaire</td><td>FRT18S6JW7</td><td>Armazenamento de curto prazo de meios</td></tr><tr><td>Incubadora de agitação (escuro)</td><td>Thermolyne</td><td>M49235</td><td>Incubadora de agitação orbital capaz de 100-150 RPM, faixa de temperatura 24-28 &deg;C; usado em condições escuras para suportar o crescimento heterotrófico de Euglena.</td></tr><tr><td>Frasco de spray (32 oz)</td><td>Boardwalk</td><td>BWK03010</td><td>Usado para esterilização de bancada e manuseio asséptico de rotina (solução de etanol a 70%)</td></tr><tr><td>Software de planilha</td><td>Microsoft Excel</td><td>N/A</td><td>Coleta, organização e análise de dados</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta estéreis</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Pontas estéreis descartáveis compatíveis com pipetas P20, P200 e P1000.</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estéreis (5, 10, 25 mL)</td><td>Corning</td><td>N/A</td><td>Pipetas estéreis individualmente embrulhadas usadas para transferências de cultura e amostragem.</td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano 0,4%, líquido, estéril filtrada, adequada para cultura celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Corante vital usado para avaliação de viabilidade celular por meio do ensaio de exclusão de Azul de Tripano.</td></tr><tr><td>Tubos para coleta de amostras (50 mL)</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>Para amostragem de pH e cianeto</td></tr><tr><td>Flascos Erlenmeyer com tampa de ventilação (250-500 mL)</td><td>Corning&reg; 250 mL Policarbonato Erlenmeyer Flask com Tampa de Ventilação</td><td>431144</td><td>Flascos Erlenmeyer de policarbonato com tampas ventiladas; autoclavável; usado para culturas líquidas estéreis e não estéreis.</td></tr><tr><td>Recipientes de resíduos</td><td>Vários - em conformidade com os padrões laboratoriais estabelecidos</td><td>N/A</td><td>Sacos de autoclave e recipientes de resíduos de materiais cortantes ou vidro para descarte compatível com biossegurança.</td></tr></tbody></table>

um método para adaptar euglena gracilis a substratos à base de mandioca para cultivo heterotrófico

A Method for Adapting Euglena gracilis to Cassava-Based Substrates for Heterotrophic Cultivation

Os seguintes resultados representativos ilustram os desfechos esperados quando o protocolo descrito é aplicado com sucesso, bem como a gama de desfechos observados sob condições subótimas. Dados representativos correspondentes a esses resultados são mostrados nas Figuras 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7. Juntos, esses resultados fornecem orientações práticas para interpretar dinâmicas de crescimento, viabilidade, morfologia e resultados proteicos ao adaptar E. gracilis a substratos à base de mandioca sob condições de cultivo heterotróficas e totalmente escuras. Além disso, esses resultados validam os principais resultados biológicos do protocolo, incluindo adaptação bem-sucedida, crescimento sustentado, alta viabilidade, morfologia estável, desempenho consistente entre substratos e produção mensurável de proteínas.
Ao longo dos experimentos, foram utilizados três réplicas por tratamento (todos os tipos de meios de mandioca). Reconhecemos que o número de réplicas depende da discricionariedade e das limitações logísticas de qualquer grupo que siga os protocolos acima. A aplicação bem-sucedida desse protocolo resulta em crescimento heterotrófico sustentado de E. gracilis em meios baseados em garri sob condições totalmente escuras. Desfechos positivos são caracterizados por trajetórias de crescimento suaves e sigmoidais, divergência limitada entre réplicas e densidades celulares estáveis em fase tardia. Características morfológicas que indicaram resultados positivos e foram consistentemente observadas em populações adaptadas incluíram arredondamento celular e membranas celulares espessas. Em contraste, células colapsadas não saudáveis tipicamente aparecem irregulares, fragmentadas ou estruturalmente comprometidas e estão associadas à viabilidade reduzida, distinguindo-as das formas intactas, arredondadas ou semi-encistadas observadas em culturas adaptadas. Para referência, imagens representativas de E. gracilis do tipo selvagem exibindo morfologia alongada característica são incluídas (Figura 8) para distinguir a estrutura celular de base das formas adaptadas ou alteradas. Culturas cultivadas com 30 g de L-1 garri apresentaram crescimento integrado mais alto, medido pela área sob a curva de crescimento (AUC), em comparação com concentrações menores, sugerindo uma utilização mais eficiente do substrato da mandioca e uma adaptação fisiológica bem-sucedida (Figura 1).
Desfechos subótimos são comumente observados em concentrações de garri mais baixas (10–20 g L-1), onde o crescimento é detectável, mas reduzido em magnitude e mais variável entre as réplicas. Em concentrações mais altas (40–50 g L-1), as culturas podem atingir densidades celulares de pico elevadas; no entanto, essas condições frequentemente apresentam estabilização tardia ou aumento da variabilidade temporal (Figura 2).
Em experimentos bem-sucedidos, a viabilidade celular permanece alta durante todo o período de cultivo, com apenas pequenas flutuações no meio do experimento. Ensaios de exclusão com Tripan Blue indicam que culturas mantidas a 30 g de L-1 garri mantêm uma alta proporção de células viáveis (não coradas) em relação às não viáveis (coloridas de azul) em pontos de tempo amostrados (Figura 3). Desvios desse padrão, incluindo maior proporção de células coloridas, motilidade reduzida ou deslocamentos para morfologias arredondadas ou colapsadas, podem indicar condições subótimas e servir como gatilhos precoces para a resolução de problemas. As avaliações de viabilidade e morfológicas foram baseadas em critérios observacionais consistentes, incluindo integridade celular, motilidade direcional e prevalência relativa de formas alongadas versus arredondadas ou colapsadas.
Resultados subótimos são caracterizados por reduções transitórias na viabilidade, mais comumente observadas em concentrações de garri mais altas. Recuperação parcial pode ser observada em momentos posteriores; no entanto, essas condições apresentam maior variabilidade na viabilidade ao longo do período de cultivo (Figura 4). Esses padrões de crescimento mostram que concentrações intermediárias de substrato (por exemplo, 30 g L-1) fornecem um equilíbrio entre disponibilidade de nutrientes e estresse, resultando em um crescimento mais estável. Essas tendências refletem o impacto das condições de pré-processamento e da adaptação em etapas no desempenho da cultura, já que a exposição gradual ao aumento da complexidade do substrato apoia a melhor estabilidade fisiológica e o comportamento de crescimento reproduzível. Concentrações mais baixas limitam a produção de biomassa, enquanto concentrações mais altas levam a maior variabilidade e estabilização atrasada.
A avaliação morfológica fornece um indicador qualitativo do status de adaptação. Desfechos positivos incluem o surgimento e persistência de células arredondadas ou semi-encistadas com motilidade reduzida que permanecem intactas após subculturas repetidas (Figura 5).
Em contraste, culturas subótimas, mais associadas a cepas selvagens ou adaptação em estágio inicial, apresentam transições abruptas de células alongadas e móveis para morfologias irregulares ou colapsadas que coincidem com redução da estabilidade do crescimento.
Quando o protocolo é aplicado a substratos derivados de mandioca adicionais, incluindo polpa, pellets e cascas, culturas adaptadas de E. gracilis apresentam crescimento reprodutível em múltiplos tipos de substrato. Os resultados positivos são caracterizados por estabilização precoce das curvas de crescimento e redução do declínio em estágio tardio em relação às culturas do tipo selvagem (Figura 6).
Desfechos subótimos incluem atraso no início do crescimento ou aumento da variabilidade replicada, especialmente em substratos com maior heterogeneidade física.
A implementação bem-sucedida do protocolo gera biomassa de E. gracilis com teor mensurável de proteína bruta, conforme quantificado por análise laboratorial externa usando o método de Combustão (Dumas). As porcentagens de proteína observadas em culturas adaptadas são comparáveis às medidas em culturas selvagens, com maior produção total de proteínas correspondente ao aumento do acúmulo de biomassa (Figura 7).
O monitoramento da química dos meios apoiou as interações cultura–substrato durante a adaptação e validou a inclusão de medições de pH e cianeto no protocolo. Os valores de pH apresentaram mudanças graduais ao longo do tempo, indicando atividade metabólica e utilização do substrato, com tendências mais estáveis em culturas adaptadas. Medições com cianeto reforçaram ainda mais isso, já que culturas adaptadas mostraram reduções nos níveis detectáveis, enquanto culturas selvagens permaneceram mais variáveis. Juntos, esses resultados demonstram que essas etapas de monitoramento capturam efetivamente mudanças na química da mídia associadas à adaptação e apoiam a interpretação do desempenho cultural. Embora os mecanismos subjacentes não tenham sido investigados, isso representa uma área importante para pesquisas futuras, especialmente para aplicações em escala industrial.
O fluxo de trabalho de manutenção e consolidação de longo prazo apoiou a viabilidade contínua da linhagem adaptada de Euglena gracilis ao longo de períodos prolongados de cultura. Culturas mantidas por passagens repetidas mantiveram consistentemente motilidade, morfologia característica e comportamento de crescimento estável ao longo dos ciclos de manutenção. Embora o desempenho a longo prazo não tenha sido avaliado quantitativamente, essas observações fornecem evidências representativas de que a linhagem adaptada pode ser mantida de forma confiável sob as condições especificadas.
Juntos, esses resultados confirmam que o protocolo de adaptação suporta crescimento robusto, viabilidade e produção de biomassa de E. gracilis em substratos à base de mandioca, com desempenho consistente e níveis reduzidos de cianeto ao longo do tempo.
Todas as figuras e tabelas são fornecidas como arquivos separados e não estão incorporadas ao documento manuscrito. Preferências de posicionamento de figuras e tabelas são indicadas no texto do manuscrito usando notas entre parênteses (por exemplo, (Figura 1)). Salvo especificação em contrário, todos os números e tabelas devem aparecer abaixo da seção de Resultados Representativos na publicação final.
Todas as figuras são enviadas como arquivos individuais, com figuras multipainel fornecidas como uma única imagem combinada. Imagens de microscopia incluem barras de escala em cada painel. As figuras de dados incluem eixos rotulados com unidades de medição definidas, e barras de erro são especificadas nas legendas correspondentes das figuras.
Todas as tabelas são enviadas como arquivos individuais .xls ou .xlsx e contêm dados numéricos brutos ou resumidos, sem formatação decorativa.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Dinâmica de crescimento de E. gracilis cultivada com 10, 20 e 30 gL-1 garri sob condições totalmente escuras. Densidades médias de células são mostradas ao longo do tempo para cada concentração de substrato. Barras de erro representam o SEM entre réplicas biológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Desempenho de crescimento de E. gracilis em concentrações elevadas de garri (30–50 g L-1). Trajetórias de densidade celular ilustram diferenças na densidade máxima, no momento de estabilização e na variabilidade entre concentrações mais altas de substrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Tendências de viabilidade celular de E. gracilis cultivadas em 30 gL-1 garri medidas por exclusão de Trypan Blue. A proporção de células viáveis é mostrada em pontos de tempo amostrados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Flutuações de viabilidade de E. gracilis cultivadas em concentrações maiores de garri. Mudanças transitórias na viabilidade celular são mostradas ao longo do período experimental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig5.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Morfologia representativa de populações adaptadas de E. gracilis . Imagens representativas da microscopia de luz invertida mostram células arredondadas e semi-incisadas observadas após a adaptação. Barra de escala = XX μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig6.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 6"> 
Figura 6: Desempenho de crescimento de E. gracilis adaptado e selvagem em substratos derivados da mandioca. Trajetórias de crescimento são mostradas para culturas adaptadas e silvestres cultivadas em múltiplos produtos de mandioca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig7.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 7"> 
Figura 7: Conteúdo de proteína bruta e produção total de proteína da biomassa de E. gracilis cultivada em mandioca. O teor de proteína foi quantificado por análise externa usando o método de Combustão SGS (Dumas). A produção total de proteínas é mostrada junto com o acúmulo de biomassa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figura 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70741/70741fig8.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 8"> 
Figura 8: Morfologia representativa do tipo selvagem de E. gracilis sob condições padrão (ampliação 40X). Imagem representativa de Euglena gracilis saudável e não adaptada, mostrando morfologia alongada característica sob microscopia óptica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70741/70741fig8large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>

Um método para adaptar Euglena gracilis a substratos à base de mandioca para cultivo heterotrófico

Cassava processing generates nutrient-rich by-products that remain underutilized due to variable composition, cyanogenic compounds, and active microbial ...

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