Name: Expressão alvo de GFP no folículo piloso Usando Transdução Vivo Ex Viral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-17T19:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprenda a realizar transdução ex vivo de GFP em folículos pilosos usando histocultura e adenovírus. Este método eficiente permite estudar terapia gênica para alopecia e modificação da cor do cabelo.

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Para mais informações sobre a expressão específica de GFP no folículo piloso usando transductionplease vivo ex viral, visite <a href="http://www.springerprotocols.com/">Protocolos Springer</a> .

Os autores não têm nada a declarar.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/708">Targeted expression of GFP in the hair follicle using ex vivo viral transduction</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The correct abstract is:
There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed. 
This replaced:
The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/708">Targeted expression of GFP in the hair follicle using ex vivo viral transduction</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

expressão alvo de gfp no folículo piloso usando transdução vivo ex viral

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

O folículo piloso é um apêndice altamente complexo da pele contendo uma multiplicidade de tipos de células. O folículo sofre ciclismo constante através da vida do organismo, incluindo o crescimento e reabsorção com crescimento dependente das células-tronco específicas. O direcionamento do folículo por genes e células-tronco para alterar suas propriedades, em particular, a natureza do eixo do cabelo é, discutidos. Sistemas de cabelo do folículo de entrega são descritos, tais como lipossomas e vetores virais para terapia genética. A natureza do cabelo células-tronco do folículo é discutido, em particular, a sua pluripotência.

Expressão alvo de GFP no folículo piloso Usando Transdução Vivo Ex Viral

Existem muitos tipos celulares no folículo piloso, incluindo as células da matriz capilar, que formam a haste do cabelo, e as células-tronco, que podem iniciar a formação da haste do cabelo...

O fol&iacute;culo piloso &eacute; um ap&ecirc;ndice cut&acirc;neo complexo composto por seis cilindros conc&ecirc;ntricos com diversos tipos celulares distintos que produzem prote&iacute;nas altamente especializadas. O ciclo cont&iacute;nuo do fol&iacute;culo piloso atrav&eacute;s de suas distintas fases de crescimento torna o ap&ecirc;ndice adequado para terapia g&ecirc;nica direcionada, que potencialmente pode corrigir a calv&iacute;cie e a perda de pigmenta&ccedil;&atilde;o dos cabelos. Neste v&iacute;deo, demonstramos um m&eacute;todo para o cultivo histol&oacute;gico de cabelo, crescimento da pele e transdu&ccedil;&atilde;o ex vivo de fol&iacute;culos pilosos com prote&iacute;na verde fluorescente.Essa técnica eficiente de transdução é útil para acompanhar a atividade do promotor de vários genes de interesse em diversas regiões do folículo durante todo o seu ciclo de crescimento. Meu nome é Robert Hoffman. Sou presidente da Anti-Cancer Inc.Hoje vamos mostrar procedimentos muito poderosos para terapia gênica do folículo capilar. Este protocolo começa com a histocultura da pele, seguida pelo tratamento com colagenase. Primeiro, sacrifica-se o miser seis dias após a depleção, e a pele das costas é removida ao nível do subcu.Após a remoção da pele, o tecido subcutâneo é removido. Em seguida, a pele é lavada em PBS sem cálcio e magnésio. Neste ponto, a pele dissecada é transferida para o meio após a lavagem com PBS.As amostras de pele são cortadas em pequenos pedaços com aproximadamente um milímetro cúbico. Uma fração dos espécimes é separada e cultivada em RPMI 1640 e 10% de soro bovino fetal como controles não tratados. O restante dos espécimes é incubado em dois mg por mililitro.Solução de colagenase. Em meio RPMI por 45 minutos a 3,75 horas a 37 graus, os espécimes digeridos são então lavados em PBS sem cálcio e magnésio. Culturas histológicas podem ser infectadas com vírus para transdução de GFP. Agora que a colagenase tornou os folículos capilares mais acessíveis ao vírus, é possível induzir os folículos capilares.Para expressar GFP, eles são primeiro infectados com o adenovírus. Um plasmídeo contendo GFP é então adicionado à pele tratada com colagenase. Culturas histológicas em 2,4 milhões a 5 bilhões de unidades formadoras de placa por mililitro.Após a adição do vírus, os espécimes são colocados no incubador por um a seis horas após a transdução viral da GFP em culturas histológicas de pele e cerca de 24 horas após a coleta, podendo então ser enxertados em camundongos nu ou C57 black six. A expressão da GFP pode ser avaliada por microscopia de fluorescência realizada em culturas histológicas ou visualizada in vivo na pele enxertada. Para determinar a eficiência da transdução da GFP, o número total de folículos pilosos e o número de folículos pilosos positivos para GFP são determinados por microscopia de campo claro e microscopia de fluorescência.São analisados cinco campos microscópicos escolhidos aleatoriamente, cobrindo uma área de 0,581 milímetros quadrados. Para a expressão de GFP, são contados pelo menos 500 pelos por espécime para determinar a porcentagem de folículos pilosos positivos para GFP. Os folículos pilosos nos quais o GFP é visualizado em qualquer região da lâmpada ou do eixo do pelo são considerados positivos para GFP.Acabamos de mostrar a você um método altamente eficiente para a transdução de GFP e folículos pilosos, que será extremamente útil para a terapia gênica. Esse conhecimento tem grande importância clínica, pois possui implicações para a cura da alopecia ou calvície, prevenção da alopecia induzida por quimioterapia e modificação permanente da cor do cabelo. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós apresentamos uma técnica lentiviral para a manipulação genética e visualização de axônio único neurônio olfactory sensoriais e sua arborização...

Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

A resolução temporal e espacial das manipulações genéticas determina o espectro de fenômenos biológicos que possam perturbar. Aqui usamos temporal e espacialmente...

Segmentação Olfactory Neurônios Bulb Usando Combinado In Vivo Eletroporação e Gal4-Based Enhancer Lines Armadilha Zebrafish

Tissue-specific análise de um modelo de regeneração do cabelo folicular usando lentivírus para mediar o ganho ou perda de função.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias...

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Descrevemos um método para caracterizar a topografia funcional e as propriedades sinápticas dos circuitos do prosencéfalo usando uma abordagem optogenética para fotoestimular populações neuronais in vitro.

Fotoestimulação de varredura a laser de circuitos de prosencéfalo optogeneticamente direcionados

A pele é um tecido-alvo do patógeno humano vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). Para explorar a rota de invasão do HSV-1 no tecido, estabelecemos um modelo de infecção ex vivo de lâminas epidérmicas murinas que representam a camada mais externa da pele.

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.

Método do tubo de rolo modificados para precisamente localizadas e repetitivas imagens intermitentes durante a cultura a longo prazo de fatias de cérebro em um sistema fechado

Intraspinal injeção de recombinase dependente recombinante vírus adeno-associado (rAAV) pode ser usada para manipular qualquer tipo de célula geneticamente rotulados na medula espinhal. Aqui descrevemos como transduce neurônios no Corno dorsal da medula espinhal lombar. Esta técnica permite interrogatório funcional do subtipo neurônio manipulado.

Expressão do Transgene de mediada por vírus adeno-associado em geneticamente definidos neurônios da medula espinhal

Aqui, apresentamos um método de distribuição de vetores de expressão viral no cérebro usando filmes de seda da fibroína. Esse método permite que o alvo entrega de vetores de expressão usando windows cranianas, cônico de fibras ópticas e fibras ópticas revestidas de seda/AAV.

Na Vivo Alvo expressão de proteínas de Optogenetic usando seda/AAV filmes

Aprenda a realizar transdução ex vivo de GFP em folículos pilosos usando histocultura e adenovírus. Este método eficiente permite estudar terapia gênica para alopecia e modificação da cor do cabelo.

Expressão alvo de GFP no folículo piloso Usando Transdução Vivo Ex Viral

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