Name: Tradução de mRNA In Vitro Livre de Células em Lisados de Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda a realizar tradução de mRNA in vitro livre de células usando lisados de embriões de Drosophila. Este protocolo permite estudar síntese proteica e controle translacional em múltiplas espécies de Drosophila.

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<table><tbody><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td>Folha de alumínio doméstica padrão; qualquer marca comercial equivalente aceitável.</td></tr><tr><td>Mistura de aminoácidos</td><td>Promega</td><td>L4461</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Vinagre de maçã</td><td>Heinz</td><td>N/A</td><td>Vinagre de maçã comercial (5% de acidez); qualquer marca equivalente aceitável.</td></tr><tr><td>Suco de maçã ou uva</td><td>Jumex</td><td>N/A</td><td>Suco de uva comercial; ou qualquer marca comercial equivalente.</td></tr><tr><td>Ágar bacteriológico</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9002-18-0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Ácido bórico (H3BO3)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td>BioReagent, grau de biologia molecular, &ge;99,5%, pó; usado para preparação do tampão TBE.</td></tr><tr><td>Cápsula: Anti reverso cap (ARCA): 3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)G Estrutura de RNA cap</td><td>BioLabs</td><td>S1411S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cápsula: m7G(5')ppp(5')G Estrutura análoga do RNA cap</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cápsula: Análogo de cap não funcional G(5&acute;)ppp(5&acute;)A</td><td>New England Biolabs</td><td>S1406</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga (15 mL)</td><td>Corning</td><td>430053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cocktail completo de inibidores de protease sem EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fosfocreatina quinase do músculo de coelho</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>C-3755</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Ácido fosfórico de creatina, sal dissódica</td><td>Merck</td><td>1120A47950</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Levedura de padeiro desidratada</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>Levedura seca ativa comercial; qualquer marca equivalente aceitável.</td></tr><tr><td>Diethyl pirocarbornato</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>97%(NNR)</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster linha selvagem tipo Oregon-R</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center, Indiana, EUA</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu/index.html ; linhagens mutantes de Drosophila melanogaster, bem como linhagens de referência selvagem de outras espécies de Drosophila, como virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, etc. também são fornecidas por este Centro de Estoque.</td></tr><tr><td>Ácido etileno-diamino-tetraacético (EDTA)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Reagente ACS, 99,4-100,6%, pó; usado para preparação do tampão TBE.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>SLBH4583V</td><td>99,5%(titrage)</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio (H2O2)</td><td>Equate</td><td>N/A</td><td>Peróxido de hidrogênio comercial (~2,5-3,5% solução de peróxido de hidrogênio; qualquer marca equivalente aceitável.</td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de luciferase in vitro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1344 e AM1348</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KOAc, também chamado de KCH3COO</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Vários</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Broth Lb (lennox)</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de luciferase</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Kit de transcrição in vitro MAXIscript T7, T3 ou SP6</td><td>Invitrogen</td><td>AM1316 e AM1312</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mg(OAc)2, também chamado de Mg(CH3COO)2</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>Vários</td><td>N/A</td></tr><tr><td>NaCl (cloreto de sódio)</td><td>J.T Baker</td><td>B17W53</td><td>Reagente ACS</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td>Qualquer empresa</td><td>N/A</td><td>Sequência específica.</td></tr><tr><td>Buffer de lise passiva 5X</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td>Pontas amarelas de 200 microliters.</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td>Pontas azuis de 1ml.</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta</td><td>Axygen</td><td>T-300</td><td>Pontas transparentes de 0,5-10 microliters.</td></tr><tr><td>Ácido propiônico</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>79-09-04</td><td>Reagente de grau ACS, &ge;99,5%, líquido.</td></tr><tr><td>Mola de vidro de 5 mL PYREX&reg;</td><td>PYREX&reg;</td><td>7724-5</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Kit QIAprep spin plasmid miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Kit QIAquick de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Liater de reticulócitos de coelho (RRL)</td><td>Promega</td><td>L4960</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sistema de ensaio de luciferase Renilla (RLuc)</td><td>Promega</td><td>E2820</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Inibidor de ribonuclease RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Kit de limpeza de RNA RNeasy minielute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cassettes de diálise Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>87735 (No entanto, depende do tamanho de corte molecular).</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio (alvejante)</td><td>Clorox</td><td>N/A</td><td>Alvejante comercial (~5-6% NaOCl); qualquer marca comercial equivalente com concentração semelhante aceitável.</td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Merck</td><td>85558</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Peneira de aço inoxidável</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer fornecedor comercial.</td></tr><tr><td>Taq plus precisão DNA polimerase</td><td>Stratagene</td><td>600211-51</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Ácido ribonucleico de transferência (tRNA) de fígado bovino tipo XI</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>9014-25-9 ou R4752</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris (base Tris)</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70145</td><td>Pó de grau de biologia molecular; usado para preparação do tampão TBE.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SLBX9437</td><td>Grau Labora

tradução de mrna in vitro livre de células em lisados de drosophila

Cell-Free In Vitro mRNA Translation In Drosophila Lysates

Tradução de mRNA In Vitro Livre de Células em Lisados de Drosophila

Cell-free mRNA in vitro translation has played a crucial role in the understanding of the protein synthesis process during gene expression across ...

Nossa pesquisa utiliza um sistema de tradução livre de células de drosófila para estudar a síntese proteica e a revelação traducional em vários estágios do desenvolvimento de insetos. Este protocolo recapitula com precisão eventos de tradução in vivo específicos ao desenvolvimento de insetos, ao contrário dos lisados de metazoários distantes. Para começar, abra o software de clonagem Benchling.Selecione um plasmídeo apropriado para inserir a construção contendo uma região não traduzida cinco prime, um cistrão repórter de luciferase de vaga-lume, ou Fluc, uma região não traduzida três prime e uma cauda poliadenilada ou poli(A) a jusante de um promotor T7. Utilize o sítio de restrição único de KPN1 imediatamente a jusante da cauda poli(A) para linearizar cada construção plasmidial antes da transcrição. Verifique os picos limpos e bem resolvidos das construções obtidos por sequenciamento antes de utilizá-los como modelos para transcrição in vitro.Realize a eletroforese em gel de agarose a 1% com 100 volts por uma hora para separar o DNA linearizado. Extraia o DNA linearizado do gel. Coloque-o em um microtubo e adicione o tampão de digestão de agarose ou ADB para purificação do DNA.Inc

cell-free-in-vitro-mrna-translation-in-drosophila-lysates

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Descrevemos a seguir os processos de extracção e purificação de ARNm e metabolitos...

Purificação de Transcrições e metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabeças

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