Avaliação do Efeito de Filtros e Pré-Filtros Revestidos na Infectividade e Concentração do Vírus Phi6 Aerossolizado

Investigamos o efeito dos pré-filtros e revestimentos antivirais na redução da infectividade e concentração de vírus transmitidos pelo ar em ambientes internos. As abordagens atuais deixam de lado dinâmicas realistas do fluxo de ar. Nosso protocolo recria condições de aerossol e mede tanto vírus infecciosos quanto a carga viral total.

Para começar, dilua a suspensão purificada do bacteriófago phi6 em um tampão de fosfato de potássio 20 milimolares contendo um cloreto de magnésio milimolar ajustado ao pH 7,2. Monte todos os materiais do filtro, pré-filtro e revestimento antiviral dentro do gabinete de biossegurança para realizar os testes de superfície. Avalie a atividade antiviral de todos os materiais de revestimento baseados em cobre, ou componentes ativos de cobre e prata embutidos em matrizes proprietárias, nomeadamente A6, B4, VS e VS B em peças de teste planas.

Em seguida, pipetei 20 microlitros de solução diluída de bactériófagos phi6 em peças de teste revestidas para realizar o ensaio de viabilidade superficial. Espalhe a amostra uniformemente em uma área de dois por dois centímetros usando um triângulo de vidro estéril. Incube as amostras a 22 graus Celsius até quatro pontos de tempo, incluindo um minuto, cinco minutos, uma hora ou três horas.

Adicione 180 microlitros de caldo LB fresco à superfície para recuperar os vírus após cada ponto temporal. Lave a superfície pipetando repetidamente de 10 a 20 vezes para coletar a amostra. Use uma placa de Petri plástica como superfície de controle.

Quantifique a eficácia antiviral dos revestimentos superficiais usando ensaio de placas para medir o número de partículas virais infecciosas e reação quantitativa da polimerase da transcriptase reversa, ou qRT-PCR, para determinar o número de cópias do genoma viral. Dilua a suspensão purificada e concentrada do bacteriófago phi6, como demonstrado anteriormente, para obter uma concentração viral na faixa de 2,5 vezes 10 até a potência de 10, e 4,08 vezes 10 até a potência de 11 unidades formadoras de placa por mililitro. Em seguida, monte a câmara experimental de aerossol usando um corpo cilíndrico de vidro com tampa correspondente.

Insira o andaime metálico interno na câmara e fixe as juntas isoladoras para garantir uma vedação hermética. Use um nebulizador em combinação com uma bomba de ar para gerar uma entrada estável e reprodutível de aerossóis virais. Titule a solução viral usada no nebulizador antes e depois de cada experimento para monitorar a estabilidade.

Ajuste a vazão do aerossol para oito litros por minuto dentro da câmara. Para reduzir a umidade durante medições prolongadas, direcione aproximadamente três quartos do fluxo de aerossol para o escapamento através de um filtro de ar particulado de alta eficiência, ou HEPA. Permita que o quarto restante do fluxo correspondente a dois litros por minuto entre na câmara.

Use um funil para direcionar o fluxo de aerossol em direção ao filtro ou à superfície do pré-filtro dentro da câmara. Desumidifice o fluxo de ar que sai usando um dessecador para proteger o filtro HEPA e o medidor de fluxo contra umidade excessiva. Usando a bomba externa, crie pressão negativa dentro do sistema e apoie ainda mais o fluxo de ar para garantir uma exaustão eficiente pela saída.

Avalie as propriedades antivirais dos pré-filtros de poliéster e bulpren não revestidos ou revestidos com VS B, juntamente com materiais de fibra de vidro em dupla camada dentro da câmara de aerossol. Para avaliar o efeito antiviral por amostragem por impactação, posicione uma placa de Petri contendo tampão HEPES de 20 milimolares a pH 7,2 diretamente abaixo do pré-filtro de teste para maximizar a deposição de partículas. Alternativamente, para testar o efeito antiviral dos filtros GF2, instale um impinger girante todo de vidro com três bicos conectado a uma bomba externa para coleta de aerossol.

Mantenha o fluxo de ar através do pré-filtro ou filtro de teste a dois litros por minuto. Aumente o influxo total de ar para 10 litros por minuto usando uma válvula adicional após a saída da câmara. Capture os aerossóis em cinco mililitros de tampão HEPES de 20 milimolares.

E reabasteça o buffer evaporado a cada 30 minutos. Para amostragem triplicada, realize execuções de controle sem pré-filtros ou filtros por 15 minutos antes e depois de cada experimento. Após a execução de controle pré-experimento, insira o filtro ou pré-filtro na câmara e opere o sistema por três horas.

Colete aerossóis virais recuperando um mililitro de suspensão de placas de Petri contendo 20 mililitros de tampão a cada 30 minutos. Remova o filtro e realize uma corrida de controle pós-experimento. Colete amostras a cada 30 minutos durante o experimento para obter oito amostras qRT-PCR e titulação cada, por experimento.

Em experimentos com impinger, colete amostras de titulação apenas uma vez ao final da corrida de três horas. Use 800 microlitros da amostra coletada para análise qRT-PCR e os 200 microlitros restantes para a titulação do vírus. Congele rapidamente amostras de qRT-PCR em nitrogênio líquido e armazene-as a 80 graus Celsius.

Processe imediatamente as amostras de titulação do vírus usando ensaio de placa. Os ensaios de viabilidade em superfície demonstraram que todos os revestimentos testados inativaram o vírus com sucesso, com reduções significativas observadas nos primeiros cinco minutos. O revestimento superficial à base de cobre, B4, alcançou a redução mais rápida, diminuindo a contagem infecciosa em três ordens de magnitude em cinco minutos e atingindo a inativação completa com limite de detecção abaixo de 100 unidades formadoras de placas por mililitro em 15 minutos.

O revestimento A6 atingiu a inativação total do vírus em 25 minutos, e o VS B em 60 minutos. O revestimento VS apresentou a taxa de inativação mais lenta entre os materiais testados. Os pré-filtros estudados BP6, S11 e FMR5 foram igualmente eficazes em reduzir o número de vírus infecciosos, passando por eles em 1,5 a 2 ordens de magnitude em comparação com o controle sem filtro.

Os filtros GF2 demonstraram desempenho superior, reduzindo a carga viral em pelo menos seis ordens de magnitude, e nenhuma placa infecciosa do vírus phi6 foi detectada dentro do limite de detecção. O revestimento VS B não afetou significativamente a eficácia da filtração do vírus infeccioso em comparação com os pré-filtros não revestidos. Os resultados da qRT-PCR mostraram que pré-filtros reduziram o número de cópias do genoma viral em até duas ordens de grandeza.

O filtro GF2 mostrou uma diminuição de até quatro ordens de magnitude em comparação ao controle sem filtro. Embora as diferenças entre pré-filtros e controle tenham permanecido insignificantes durante os primeiros 30 minutos, a eficiência do filtragem mecânica aumentou a partir do ponto de 60 minutos. Além disso, a aplicação do revestimento VS B não teve efeito mensurável sobre o número de genomas virais que passam pelo meio filtrante.

Esse protocolo permite aos pesquisadores quantificar a inativação viral, a eficiência da filtração e as diferenças entre partículas infecciosas e a carga viral total. Um desafio fundamental é o tempo muito curto de contato com a superfície do vírus durante o fluxo de ar, o que limita a eficácia dos revestimentos antivirais. Estudos futuros podem explorar a combinação de revestimentos com UV ou testes de desempenho em sistemas de ventilação do mundo real e com diversos vírus.