Marcação Endógena Fluorescente Mediada por CRISPR/Cas9 de Genes Específicos da Linhagem Germântica em Caenorhabditis elegans

Utilizamos marcação endógena baseada em CRISPR para estudar a localização e dinâmica das proteínas germinativas em C. elegans. Transgenes convencionais podem afetar a expressão da linha germinativa, mas esse protocolo marca proteínas no locus endógeno sob controle nativo. Para começar, identifique os genes candidatos com expressão predominante na gônada ou nas células germinativas usando bancos de dados públicos e literatura publicada.

Após abrir a entrada UniProt para a proteína alvo, clique em Estrutura para avaliar características estruturais e domínios proteicos e identificar um local apropriado de marcação fluorescente. Desça e abra a entrada do AlphaFold no banco de dados para verificar os valores de confiança do modelo. Clique em Domínios para classificações estruturais específicas.

Em seguida, abra a página do gene alvo no WormBase. Role para baixo e clique no widget Sequências, e no link principal da transcrição para abrir a página da transcrição. Desça até a seção Sequências e clique na opção específica para revelar a sequência emendada da transcrição selecionada.

Na página da Ferramenta de Design de RNA do Guia IDT-CRISPA-Cas9, copie e cole a primeira sequência de exons do gene-alvo da página WormBase e selecione C, elegans no menu suspenso de Espécies para o design de RNA ou gRNA de guia. Clique no botão DESIGN para obter e revisar a sequência de gRNA mais recomendada e sua sequência PAM correspondente. No SnapGene, selecione Sequência para identificar o ponto de clonagem entre o promotor CeU6 e as regiões do andaime de gRNA.

Copie a sequência de gRNA da página da ferramenta IDT, cole na caixa de diálogo de inserção e clique em Inserir para integrar o espaçador ao plasmídeo de expressão CRISPR. Para confirmar a precisão da inserção do gRNA, selecione a sequência e clique em Mostrar alinhamentos para comparar o resultado do sequenciamento Sanger base por base com a sequência esperada. Para construir o plasmídeo doador, copie as sequências genômicas do braço de homologia a partir do WormBase.

No SnapGene, cole a sequência e clique em Inserir. Em seguida, clique com o botão direito no local de inserção para abrir a janela Definir Cor do DNA e mude para Laranja para marcar a junção. Copie a sequência de inserção da proteína fluorescente verde ou GFP e cole diretamente na posição marcada.

Depois, clique em Adicionar Recurso. Cite a funcionalidade GFP. Mude a cor da tela para verde e clique em OK para completar a montagem do plasmídeo doador in silico.

Para introduzir uma substituição silenciosa no molde do plasmídeo doador para evitar o recorte do Cas9 após a integração, copie o espaçador de gRNA de 19 nucleotídeos do vetor de expressão. Na aba plasmídeo do doador, cole a sequência na barra de busca de sequência de DNA para localizar o local alvo e selecione a posição específica do nucleotídeo a sofrer mutação. Em Substituir base, insira novo nucleotídeo e clique em Inserir.

Clique com o botão direito na base modificada e use Set DNA Color para mudar a cor para vermelho. Alinhe os resultados do sequenciamento de Sanger do plasmídeo doador com a sequência esperada para confirmar a integridade. Prepare a mistura de injeção combinando o plasmídeo de expressão CRISPR, o plasmídeo doador e marcadores de coinjeção em água dupla destilada estéril até um volume final de 10 microlitros na concentração apresentada.

Depois, centrifuge a mistura a 10.000 g por 10 a 20 minutos para eliminar partículas e evitar o entupimento do capilar de microinjeção. Use um puxador de agulha para criar agulhas de microinjeção a partir de capilares de vidro, com um afilamento longo e ponta afiada, adequadas para injeção gonadal, enquanto otimiza empiricamente as configurações polares. Aqueça uma micropipeta capilar e partia-a em duas partes para criar uma ferramenta de carga.

Prenda uma lâmpada aspiradora de borracha na extremidade larga da micropipeta microcapilar encurtada. Aspire aproximadamente um microlitro de mistura de injeção no carregador. Insira o carregador na parte de trás da agulha de injeção e dispense delicadamente a mistura de injeção.

Coloque a agulha carregada na horizontal por 10 minutos para formar uma coluna contínua e permitir que a solução se deposite em direção à ponta. Monte a agulha no microscópio de injeção e coloque a ponta em foco usando óptica de campo claro. Abra a ponta da agulha com um toque suave na borda de uma capa de capa em óleo de halocarbonetos e verifique o fluxo.

Para cultivar as minhocas para injeção, mantenha as minhocas selvagens N2 em placas de mídia com sementes de bactérias OP50. Selecione hermafroditas no estágio L4 de uma placa saudável e incube a 20 graus Celsius por 10 horas para obter jovens adultos com linhas germinativas bem desenvolvidas. Transfira minhocas para uma placa sem sementes para reduzir a transmissão bacteriana.

Prepare uma almofada seca de 2%agarose em uma lâmina de vidro. E aplique uma gota de óleo de halocarboneto. Use um apanhador de cílios para transferir uma minhoca para a almofada de agarose e imobilizá-la.

Use um objetivo de baixa ampliação para orientar a gônada para a injeção. Use controles do micromanipulador para posicionar a agulha em um ângulo de 20 a 40 graus em relação à minhoca. Use alta ampliação para focar na linha germinativa distal.

Avance o verme sobre a agulha e posicione a ponta dentro do sincito gonadal. Injete a solução até a gônada inchar. Retire a agulha e reposicione para as injeções seguintes.

Adicione um buffer M9 para amolecer e descomponha parcialmente a almofada de agarose para liberar minhocas. Transfira cada verme para uma placa de recuperação individual. Depois, repetir as injeções para 20 a 25 vermes.

Analise a prole F1 para marcadores de co-injeção e selecione animais positivos para marcadores. Transfira cada verme F1 para uma placa individual e permita um a dois dias para a postura dos ovos. Lisar cada verme F1 em tampão de proteinase K para preparar os modelos de PCR.

Realize PCR por junção usando um primer genômico fora do braço de homologia e um primer interno do tag. E mantêm placas correspondentes de animais F1 positivos para PCR. Isolar a prole F2 das linhas F1 positivas para PCR em placas individuais para produzir descendentes.

Lyse adultos para genotipagem. Realize PCR usando espoletas flanqueando os braços de homologia para distinguir alelos do tipo selvagem e knock-in pelo tamanho do produto. Use a ferramenta SnapGene para verificar e validar a integração correta tanto nas junções de inserção esquerda quanto direita, alinhando os resultados do sequenciamento Sanger com a sequência genômica editada esperada.

Use microscopia de fluorescência para verificar a expressão e localização da linha germinativa. Expanda linhas homozigotas confirmadas. Mantenha estoques e linhas validadas em criopreservação para armazenamento a longo prazo.

A triagem baseada em PCR da prole F1 revelou knock-ins bem-sucedidos identificados por amplicã de PCR de junção de 1.550 pares de bases, utilizando um primer genômico lateral e um primer interno de GFP. A ausência da banda de 1.550 pares de bases na maioria dos animais F1 indicou que não havia integração detectável do alvo, consistente com transmissão de DNA não integrativa em vez de reparo dirigido por homologia. A determinação de zigosidade em descendentes F2 derivados de linhas PCR-positivas em junção distingue alelos pelo tamanho da banda em 1.345 pares de bases como alelo do tipo selvagem, e 2.344 pares de bases como alelo knock-in.

Heterozigotos mostram ambas as bandas. Amostras homozigóticas knock-in não possuem a faixa do tipo selvagem, e as amostras com falha na integração mostram apenas o produto do tamanho do tipo selvagem. Validação adicional da linha homozigótica de knock-in da GFP foi feita usando imagem microscópica confocal, onde foi observada fluorescência da GFP nas células germinativas com sinal enriquecido na região espermatogênica.

Esse protocolo permite a análise in vivo da localização e dinâmica de proteínas na linha germinativa de C. elegans. O design cuidadoso das etiquetas e a validação minuciosa são essenciais para preservar a função das proteínas e minimizar candidatos a falsos positivos. Estudos futuros podem usar esse fluxo de trabalho para acompanhar a localização de proteínas e explorar possíveis interações durante o desenvolvimento da linhagem germinativa.