Um Protocolo Simplificado para Microscopia de Localização de Molécula Única em Núcleos de Arabidopsis

Minha pesquisa foca em edição de epigenoma e visualização da organização da cromatina em núcleos de Arabidopsis usando microscopia de super resolução. Os métodos existentes não são adaptados para a imagem STORM. Esse protocolo melhora a pureza dos núcleos, a consistência da marcação, a montagem da amostra e a estabilidade da imagem.

Aplica-se à Arabidopsis thaliana e a outros sistemas de plantas para estudar organização nuclear, estrutura da cromatina e epigenética em alta resolução. Para começar, coloque uma placa de cultura de seis poços no gelo sob a exaustão. Misture a solução de fixação contendo 4% de volume por volume, formaldeído estabilizado por metanol 0,1%, Triton X100 e PBS.

Adicione aproximadamente quatro mililitros de solução de fixação gelada em cada poço sob a exaustor. Usando pinças limpas, remova as mudas de Arabidopsis que estão entre oito e quinze dias após a germinação de Murashige e Skoog sólidos de meia concentração, ou meio MS. Imediatamente submerga as mudas na solução de fixação e coloque aproximadamente 20 mudas por poço.

Use três poços para obter material suficiente por amostra. Coloque a placa na câmara de vácuo cheia de gelo e feche-a. Aplique um ciclo de vácuo entre menos 0,6 bar e menos 0,8 bar por 15 minutos para remover o ar preso e permitir uma penetração profunda do fixativo nos tecidos da planta.

Depois, libere o vácuo lentamente. Misture a amostra e aplique o vácuo por mais 15 minutos. Sob a exaustor, remova a solução de fixação com uma pipeta.

Lave cada poço três vezes por 10 minutos em cada uma sob agitação suave, usando cinco mililitros de PBS gelado. Após as lavagens, remova o PBS. Usando pinças, transfira o tecido fixo para uma placa de Petri de 120 por 120 milímetros e adicione 50 microlitros de tampão de isolamento de núcleos às mudas fixas.

Com uma lâmina, corte o papel fixo. Usando a mesma lâmina, raspe o tecido picado até uma das bordas da placa de Petri. Adicione 600 microlitros de tampão de isolamento de núcleos e lave qualquer tecido grudado na lâmina.

Transfira a pasta de tecido para um tubo homogeneizador Dounce de dois mililitros e acaricie de cinco a dez vezes com o pilão menor. Depois, acaricie com o pilão maior até que ele se mova suavemente dentro do tubo, normalmente exigindo de cinco a dez golpes. Filtre a amostra homogeneizada através de um filtro de malha de 30 micrômetros para um tubo de 50 mililitros.

Transfira o filtrado para um tubo novo de 1,5 mililitro. Centrifuge a suspensão por 10 minutos a 800G usando a rampa mais baixa tanto para aceleração quanto para desaceleração. Após a centrifugação, observe que um pequeno pellet branco é visível entre os detritos de tecido verde.

Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 600 microlitros de buffer de isolamento de núcleos. Centrifuge novamente por 10 minutos a 800G e remova o sobrenadante. Após lavar completamente os detritos verdes, armazene a suspensão isolada dos núcleos a quatro graus Celsius por no máximo uma semana e imunotinga os núcleos com os anticorpos desejados.

Aqueça a solução de agarose de baixa fusão a 1,5% de peso por volume a 90 graus Celsius por um minuto para dissolver o pó e obter uma solução clara. Vortex brevemente para garantir uma mistura completa. Resfrie a solução e mantenha-a a 37 graus Celsius antes de prosseguir para evitar a desnaturalização térmica do tampão da glicose oxidase.

Após a solução de agarose de baixa fusão atingir 37 graus Celsius, prepare o tampão STORM adicionando 100 milimolares de mercaptoetilamina e tampão de glicose oxidase à agarose de baixa fusão para alcançar uma concentração final 1X e misture a solução suavemente. Deposite 10 microlitros da mistura de núcleos em uma camada de cobertura de 1,5H tratada com ozônio, que tenha sido tratada por 20 minutos em um sistema de limpeza por ozônio ultravioleta. Espere três minutos para permitir que os núcleos se depositem no slip de cobertura.

Depois, remova o excesso de líquido e espere dois minutos. Adicione 10 microlitros da agarose preparada de baixa fusão à capa e cubra imediatamente com uma lâmina de microscópio. Sele a capa com selante silicone.

Misture quantidades iguais da solução A e da solução B em uma pequena placa de Petri usando uma ponta de micropipeta. Aplique a mistura sobre as bordas do engobe de cobertura para selar a amostra. Deixe o selante de silicone endurecer por cinco minutos.

Monte a lâmina da amostra no microscópio e encontre o foco. Localize e foque em um núcleo. Ative um módulo de manutenção de foco, se disponível, para garantir estabilidade durante aquisições longas.

Selecione uma região onde um ou alguns nanodiamantes estejam posicionados próximos ao núcleo para melhorar a correção de deriva durante a reconstrução. Para imagens de duas cores, comece a aquisição com o canal de comprimento de onda mais longo e depois mude para o canal de comprimento de onda mais curto para completar a imagem. Processe as pilhas de imagens brutas no ThunderSTORM usando ajuste Gaussiano com estimativa de mínimos quadrados ponderados e gere imagens reconstruídas.

Aplique filtragem baseada em sigma e incerteza abaixo de 30 nanômetros para manter localizações precisas e remover ruído. Por fim, realize a correção de deriva da amostra usando correlação cruzada ThunderSTORM ou o algoritmo COMET e confirme deriva mínima nas imagens reconstruídas. Núcleos foram isolados de mudas selvagens de 15 dias de idade, imunomarcadas com anticorpos secundários conjugados AF647 e contra-coloridos com Hoechst H33258.

A imagem confocal mostrou múltiplos núcleos isolados e bem preservados com detritos mínimos, com cromocentros e o nucléolo claramente distinguíveis. O sinal da RNA polimerase II estava ausente dos cromocentros e do nucléolo. Projeções de intensidade máxima limitadas pela difração e as correspondentes reconstruções do SMLM revelaram detalhes estruturais da marcação da RNA polimerase II e do DNA, incluindo regiões ampliadas de interesse que apresentavam estruturas mais finas.

A filtragem de localização baseada em sigma e incerteza melhorou a definição tanto dos sinais da RNA polimerase II quanto do DNA em comparação com localizações detectadas. E o refinamento adicional após correção de deriva manteve essa estrutura aprimorada. Filtragem baseada em valores sigma removia localizações com larguras ajustadas excessivamente pequenas ou grandes.

A análise de correlação em anel de Fourier mostrou que a resolução no canal AF647 melhorou de 90,1 para 47,7 nanômetros após a filtragem, enquanto o canal JF549 melhorou de 56,6 para 27,9 nanômetros. Manter a integridade nuclear enquanto minimiza detritos e fluorescência de fundo é fundamental para alcançar imagens de molécula única de alta qualidade. Estudos futuros podem vincular a arquitetura nuclear à regulação gênica sob condições ambientais ou de desenvolvimento.