Name: Identificação de histonas modificadas como substratos de ligação do membro humano da família spindlina 4 (SPIN4) por matrizes peptídicas e pulldown nativo de nucleossomos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a identificar substratos de ligação da proteína SPIN4 usando matrizes peptídicas e pulldown de nucleossomos nativos. Este protocolo permite caracterizar a especificidade de leitores de histonas em epigenética.

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<ol><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+variant+in+SPIN4+causes+an+X-linked+overgrowth+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome.</a> JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).</li>
<li>Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+observation+of+a+rare+Binder+phenotype+with+fetal+overgrowth+due+to+a+SPIN4+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Matern+Fetal+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation.</a> Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).</li>
<li>Lu, R., Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tudor%3A+a+versatile+family+of+histone+methylation+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Tudor: a versatile family of histone methylation readers.</a> Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).</li>
<li>Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+engagement+of+chromatin+modifications+by+linked+binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).</li>
<li>Mauser, R., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+modified+histone+peptide+arrays+in+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Application of modified histone peptide arrays in chromatin research.</a> Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).</li>
<li>Hsu, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraspeckle+protein+NONO+regulates+active+chromatin+by+allosterically+stimulating+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1.</a> Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).</li>
<li>Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+reconstituting+enzymatic+activities+for+ultra-large+histone+methyltransferases+NSD1+and+SETD2+using+a+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system.</a> STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).</li>
<li>Fuhrmann, J., Thompson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+and+citrullination+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation.</a> ACS Chem Biol. 11, 654(2015).</li>
<li>Zhao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+histone+H3+%E2%80%9CK4me3-K9me3%2F2%E2%80%9D+methylation+pattern+readout+by+Spindlin1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1.</a> J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).</li>
<li>Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+H3K9-methylated+heterochromatin+and+its+functions+in+tissue+differentiation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).</li>
<li>Greschik, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+code+reader+Spin1+controls+skeletal+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development.</a> Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>Experimentos gerais</td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos de 15 cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903.300</td><td>Experimentos gerais</td></tr><tr><td>Tubos Centrífugos Cônicos de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.101</td><td>Experimentos gerais</td></tr><tr><td>Tubos Centrífugas Cônicas de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.548.004</td><td>Experimentos gerais</td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer de 500 mL</td><td>Stellar Scientific</td><td>CT229809</td><td>Cultura celular Sf9</td></tr><tr><td>Amersham ImageQuant 800 CCD Imager</td><td>Cytiva</td><td>IMQ800</td><td>Sistema de imagem CCD</td></tr><tr><td>Gel de afinidade anti-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td>Pulldown bioquímico</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0017</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Array Analyze Sofrware</td><td>Motivo Ativo</td><td>https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip</td><td>Análise de dados de arrays de peptídeos MODificados</td></tr><tr><td>ASI Agarose LE</td><td>Alkali Scientific</td><td>A7700</td><td>Gel de DNA</td></tr><tr><td>Sistema de Expressão de Baculovírus Bac-to-Bac</td><td>Termo Científica</td><td>10359016</td><td>Expressão baculoviral</td></tr><tr><td>Cloridrato de benzamidina</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-W018781</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Albumina Sérica Bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Padrão de quantificação de proteínas</td></tr><tr><td>Azul de Bromofenol</td><td>Termo Científica</td><td>A18469.08</td><td>Amortecedor de Lammeli</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Termo Científica</td><td>20278</td><td>Coloração em gel Protien</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5545</td><td>Buffer de lise</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Produtos de pesquisa RPI</td><td>E58100</td><td>Buffer de lise</td></tr><tr><td>Substrato de Quimioluminescência Aprimorada (ECL)</td><td>Cytiva</td><td>RPN2232</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Meio de Cultura Celular de Insetos ESF 921</td><td>Sistemas de Expressão</td><td>96-001</td><td>Cultura celular Sf9</td></tr><tr><td>Etanol (200 proof)</td><td>Química do Espectro</td><td>ET107</td><td>Precipitação de DNA</td></tr><tr><td>Sistema de Imagem EVOS M5000</td><td>Invitrogen</td><td>M5000</td><td>Imagem geral</td></tr><tr><td>Peptídeo FLAG</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7006</td><td>Elução por pulldown</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G77893</td><td>Buffer de armazenamento</td></tr><tr><td>Anticorpo H3K4me1 &nbsp;</td><td>Motivo Ativo</td><td>39300</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo H3K4me2 &nbsp;</td><td>Sinalização de Celular</td><td>9725T</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticorpo H3K4me3&nbsp;</td><td>Sinalização de Celular</td><td>9751T</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>HEK293FT Células</td><td>Termo Científica</td><td>R70007</td><td>Linha de fibroblastas renais embrionárias humanas</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H3375</td><td>Buffer de lise</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionais de Saúde</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td>&nbsp; Programa de processamento de imagens baseado em Java</td></tr><tr><td>Hemissulfato de leupeptina</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-18234A</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Nuclease Microcócica (MNase)</td><td>NEB&nbsp;</td><td>M0247S</td><td>Endonuclease para digestão de cromatina</td></tr><tr><td>Modelo 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>Sonicação</td></tr><tr><td>Matriz de Peptídeos de Histonas MODIFICADAS</td><td>Motivo Ativo</td><td>13005</td><td>Ensaio de ligação a proteínas</td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P0018</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Fração de IgG de Peroxidase Monoclonal de Cabra Anti-IgG, específica de cadeia leve</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-174</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>pFastBac1-Flag-SPIN4</td><td>Termo Científica</td><td>10360014</td><td>Vetor de expressão baculoviral</td></tr><tr><td>pFastBac1-Flag-SPIN4-D82H</td><td>Termo Científica</td><td>10360014</td><td>Vetor de expressão baculoviral</td></tr><tr><td>Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Purificação de DNA</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce Rapid Gold</td><td>Termo Científica</td><td>PIA53226</td><td>Quantificaiton proteico</td></tr><tr><td>Pierce Silver Stain Kit</td><td>Termo Científica</td><td>24612</td><td>Detecção de proteínas</td></tr><tr><td>Inibidor de Protease PMSF</td><td>Termo Científica</td><td>36978</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Gel de Poliacrilamida</td><td>Fabricado internamente</td><td>N/A</td><td>Gel proteico</td></tr><tr><td>Células de insetos Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td>Linha celular de insetos para expressão de baculovírus</td></tr><tr><td>Dispositivo de Diálise Slide-A-Lyzer MINI, MWCO 10K</td><td>Termo Científica</td><td>69572</td><td>Diálise de proteínas</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>Precipitação de DNA</td></tr><tr><td>cloreto de sódio &nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP358-1</td><td>Amortecedores gerais</td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de Sódio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L3771</td><td>Amortecedores gerais</td></tr><tr><td>Solução Azul de Tripan (0,4%)</td><td>Termo Científica</td><td>15250061</td><td>Coloração de núcleos</td></tr></tbody></table>

identificação de histonas modificadas como substratos de ligação do membro humano da família spindlina 4 (spin4) por matrizes peptídicas e pulldown nativo de nucleossomos

Identification of Modified Histones as Binding Substrates of Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) by Peptide Arrays and Native Nucleosome Pulldown

Identificação de histonas modificadas como substratos de ligação do membro humano da família spindlina 4 (SPIN4) por matrizes peptídicas e pulldown nativo de nucleossomos

Human Spindlin Family Member 4 (SPIN4) has just emerged as a novel regulator of bone growth. Loss-of-function variants in SPIN4 were identified in ...

identification-modified-histones-as-binding-substrates-human-spindlin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Avanços na espectrometria de massa permitiu a análise de alto rendimento de expressão da proteína e da modificação de uma série de tecidos. Combinada com fraccionamento subcelular e modelos de doença, a massa espectrometria quantitativa e bioinformática pode revelar novas propriedades nos sistemas biológicos. O método aqui descrito analisa cromatina proteínas associadas na definição de doença cardíaca e é prontamente aplicável a...

Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.

A Abordagem ChroP Combina chip e Espectrometria de Massa dissecar proteômica Paisagens Locus específicas da cromatina

Neste protocolo, descrevemos uma nova técnica BrdU-ChIP-Slot-Western para examinar proteínas e modificações de histonas associadas a DNA recém-sintetizado ou nascente.

Exame de proteínas ligadas ao DNA em células de mamíferos Nascente usar a técnica de-BrdU-chip-Slot Ocidental

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho totalmente integrado para a caracterização de histonas modificações pós-traducionais, utilizando espectrometria de massa (MS). O fluxo de trabalho inclui a purificação histona de culturas de células ou tecidos, derivação histona e digestão, análise de MS utilizando cromatografia líquida de nano-fluxo e instruções para a análise de dados. O protocolo é projetado para a conclusão dentro de 2 - 3 dias.

Fluxo de trabalho completo para Análise de histona modificações pós-traducionais Usando Bottom-up Espectrometria de Massa: De histona Extração de Análise de Dados

Este protocolo descreve a reconstituição de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. Ao mesmo tempo, nucleossomas assimetricamente pós-translacionalmente modificados pode ser gerado após o uso de uma cópia da histona premodified. Estas preparações podem ser prontamente usadas para estudar os mecanismos de modificação de diafonia, simultaneamente em ambas as histonas irmã, utilizando espectroscopia de RMN de alta resolução.

Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Este manuscrito descreve métodos para a aplicação de tecnologia de microarrays de péptidos para o perfil específico de anticorpos que reconhecem histonas e suas modificações pós-tradução.

Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos

Aqui, descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação da cromatina de histonas modificadas de brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA é usado posteriormente para PCR quantitativo para interrogar a abundância e a localização de modificações borne-translational do histone durante todo o genoma.

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo descreve uma bateria de métodos que inclui cromatografia analítica de exclusão de tamanho para estudar a oligomerização e estabilidade da histona chaperona, ensaio pull-down para desvendar interações histona-histona-histona, AUC para analisar a estequiometria dos complexos proteicos e ensaio de chaperoning de histonas para caracterizar funcionalmente uma suposta histona chaperone in vitro.

In vitro Caracterização de Chaperones de Histonas utilizando Ensaios Analíticos, Pull-Down e Chaperoning

Um fluxo de trabalho analítico baseado em cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para alta confiança e análise "bottom-up" altamente reprodutível de modificações e identificação de histonas com base em parâmetros principais (tempo de retenção [TR], seção transversal de colisão [CCS] e relação massa-carga [m/z] precisa).

Triagem de modificação de histona usando cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo

Este artigo apresenta um procedimento experimental detalhado para reconstituir amarras de DNA contendo nucleossomos para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única. Além disso, descreve vários experimentos a jusante que podem ser conduzidos para visualizar o comportamento de ligação de proteínas que interagem com a cromatina e analisar mudanças nas propriedades físicas dos nucleossomos.

Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

O enriquecimento e sequenciamento do DNA nascente associado a proteínas (eSPAN) foi desenvolvido para detectar a abundância relativa de uma proteína associada à cromatina em duas fitas replicantes de DNA, revelando assim insights moleculares sobre a replicação da cromatina e seus processos acoplados. Este protocolo descreve procedimentos de eSPAN em células-tronco embrionárias (ES) de levedura e camundongo.

Análise específica de fitas de proteínas em fitas de DNA replicantes por enriquecimento e sequenciamento do método de DNA nascente associado a proteínas

Aprenda a identificar substratos de ligação da proteína SPIN4 usando matrizes peptídicas e pulldown de nucleossomos nativos. Este protocolo permite caracterizar a especificidade de leitores de histonas em epigenética.

Identificação de histonas modificadas como substratos de ligação do membro humano da família spindlina 4 (SPIN4) por matrizes peptídicas e pulldown nativo de nucleossomos (Vídeo) | JoVE Journal

Identificação de histonas modificadas como substratos de ligação do membro humano da família spindlina 4 (SPIN4) por matrizes peptídicas e pulldown nativo de nucleossomos

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